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Pragmatischer UHPLC So steigern Sie die Produktivität Ihrer UHPLC

Autor / Redakteur: Frank Steiner* / Dr. Ilka Ottleben

In Zeiten ständig steigender Probenaufkommen können Methoden, welche die Analysenzeit reduzieren – wie die UHPLC – einen entscheidenden Beitrag zur Wirtschaftlichkeit von Laboren leisten. Doch wie lässt sich das Potenzial der UHPLC in pragmatischer Weise optimal nutzen?

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Durch die Optimierung einiger Analyse-Parameter kann die Produktivität einer UHPLC-Anlage gesteigert werden.
Durch die Optimierung einiger Analyse-Parameter kann die Produktivität einer UHPLC-Anlage gesteigert werden.
(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Die Flüssigchromatographie hat in den letzten zehn Jahren entscheidende Fortschritte im Leistungspotenzial gemacht. Sowohl Säulen, als auch Gerätetechnologie erlauben eine erhebliche Leistungssteigerung, besonders in der Analysengeschwindigkeit. Die Fortschritte kommen jedoch nicht in allen Labors an. Ursache ist nicht ein Investitionsstau in neue Geräte und Säulen, sondern andere Hürden. So ist beispielsweise eine Softwareassistenz zur Übertragung von Methoden teilweise vorhanden, aber nur bedingt anwendbar. Trainingsangebote von Herstellern zielen oft nur auf die optimale Bedienung ihrer Produkte, nicht aber auf fundamentales Verständnis der Grundlagen.

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Auch die Regulierung der Labors (besonders in der QC der Pharmaindustrie) ist eine weitere Hürde. Daher wird der Weg von HPLC zu UHPLC oft als sehr aufwändig oder unmöglich empfunden.

Was ist eigentlich UHPLC?

Die Frage nach der Definition von UHPLC beziehungsweise ihre Abgrenzung zur HPLC wird von Herstellern in nicht uneigennütziger Weise immer wieder gestellt. Sachlich objektiv betrachtet: Es geht grundsätzlich um Leistungssteigerung in der Flüssigchromatographie unter Verwendung von Säulen mit kleineren Partikeln in optimierten Apparaturen, welche höhere Arbeitsdrücke erlauben und die verlustfreie Anwendung der entsprechenden Säulen unterstützen. Die Abgrenzung ist nicht klar definiert, die Festlegung ist aber für keinen Anwender von Nutzen.

Solides Grundlagenwissen ist hingegen unerlässlich für die erfolgreiche Implementierung leistungsstarker UHPLC-Methoden. Faustregeln sind hilfreich in der Praxis, aber sollten stets durch fundamentales Verständnis untermauert sein.

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Dieser Leitartikel soll die Potenziale der UHPLC einschließlich der Anwendung höherer Betriebstemperatur der Säulen kritisch beleuchten. Auch das Verständnis aller instrumentellen Voraussetzungen ist dabei wichtig.

Kriterien der UHPLC-Optimierung

Der Anwendernutzen lässt sich im wesentlichen durch Laborproduktivität, Kosteneffizienz und Qualität der Analysen charakterisieren. Die erstgenannten sind in Leistungsindikatoren wie Zeit pro Analyse und Kosten pro Analyse reflektiert, die Qualität ist in der Ausprägung von Validierungsparametern (Selektivität, Genauigkeit, Wiederfindung, Linearität, Nachweis- und Bestimmungsgrenzen, etc.) zu erkennen. Dabei resultieren einige Vorteile (Präzision als Bestandteil der Genauigkeit, Linearität und Nachweisstärke der Detektion) größtenteils direkt aus Weiterentwicklungen der Geräte. Es herrscht im Gegenzug oft Skepsis bezüglich der Präzision und Robustheit von UHPLC-Methoden. Diese ist meist unbegründet, schlechte Erfahrungen oftmals durch Unwissen und falsche Erwartungen der Anwender bedingt, also Anwendung ungeeigenter Methoden, Injektion ungeeignet vorbereiteter Proben oder Bedienungsfehler. Zu kurze Standzeit von Säulen im Betrieb unter manchmal extremen Bedingungen von Druck, Fluss oder Temperatur wird oft kritisiert, hier muss aber immer die maximale Anzahl von Analysen pro Säule gesehen werden, nicht in welcher Frequenz eine Säule getauscht wird.

Wichtige Grundlagen

Kinetische Optimierung in der Flüssigchromatographie kann mittels H/u-Kurven (van-Deemter-Kurven) systematisch diskutiert werden. Bodenhöhe H ist Maß für Bandenverbreiterung in der Säule, ein großes H ist schlecht, es reduziert Auflösung. Die Linerargeschwindigkeit u ist ein direktes Maß für die Analysengeschwindigkeit. Die Kurven (s. Abb. 1a) zeigen mit Pfeilmarkierung die Geschwindigkeit für optimale Auflösung (Minimum). An der Steigung des rechten Astes erkennt man den Preis der bei höherer Analysengeschwindigkeit als Bandenverbreiterung und Auflösungsverlust zu zahlen ist. Dieser ist bei unterschiedlichen dp sehr verschieden. Die Beiträge der drei Terme A, B und C zur Kurve in Form des Diffusionskoeffizienten des Analyten in der mobilen Phase Dm und des Teilchendurchmessers dp der stationären Phase sind in Gleichung 1 zu erkennen (λ, γ, ω sind weitere Säulen- oder Methodenparameter). Die Formel zeigt am Ende auch eine vereinfachte Abschätzung aller drei Terme (abhängig von dp), die für die Trennung kleiner Moleküle bei Raumtemperatur in der RP-Chromatographie recht universell gilt. Die Formel soll vor allem die Grundlage für die korrekte relative Änderung der Parameter bei Geschwindigkeitsoptimierung liefern. Teilchendurchmesser dp wirkt sich sowohl im A-Term als auch im C-Term, im C-Term sogar quadratisch aus.

Glg.1
Glg.1
(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Aus Gleichung 1 ergibt sich durch Ableitung nach u und Nullsetzen dieser die folgende wichtige Gleichung bzw. Abschätzung für das Minimum:

Glg.2
Glg.2
(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Aus dem Vergleich der H/u-Kurven bei verschiedenen Teilchendurchmessern zusammen mit der Kenntnis, dass Bodenzahl N ein Maß für die Trennleistung ist und sich aus dem Quotienten von Säulenlänge L und Bodenhöhe H ergibt (N=L/H) leiten sich drei Konsequenzen ab:

  • H-Wert im Minimum der H/u-Kurve ist zum Teilchendurchmesser dp proportional, also lässt sich durch eine Halbierung von dp bei Anpassung von u die Trennleistung (Bodenzahl N) verdoppeln.
  • Die optimale Lineargeschwindigkeit uopt (Lage des Minimums auf der x-Achse, beschrieben in Gleichung 2) verschiebt sich umgekehrt proportional zu dp. Somit ist bei Halbieren von dp zum Erreichen der optimalen Trennleistung auch die doppelte Lineargeschwindigkeit notwendig. Damit ist bei gleicher Säulenlänge nicht nur die Trennleistung verdoppelt, sondern die Methode wird automatisch doppelt so schnell.
  • Die Steigung des C-Terms (proportional zu dp²) nimmt mit kleiner werdendem dp stark ab. Nach Halbierung des Teilchendurchmessers führt z.B. eine Verdoppelung von u über das Minimum der Kurve hinaus lediglich zu ¼ der Einbuße in der Trennleistung im Vergleich zu dem originalen Teilchendurchmesser. Wesentlich weniger Nachteil bei Steigerung der Geschwindigkeit.

Mit Glg. 2 lässt sich z.B. berechnen, dass die per Faustregel geltende optimale Lineargeschwindigkeit für 5 µm Säulen bei 2 mm/s liegen sollte. Weiterer Schluss ergibt sich durch Einsetzen von uopt aus Glg. 2 in Glg. 1 und liefert den H-Wert im Kurveminimum für einen bestimmten Teilchendurchmesser dp:

Glg.3
Glg.3
(Bild: Thermo Fisher Scientific)

H-Wert einer optimal betriebenen Säule sollte nicht größer sein als das dreifache des Teilchendurchmessers der stationären Phase, bei modernen Säulen eher besser. Diese Erkenntnis erlaubt Rückschlüsse auf die verwendete Apparatur. Ist das bei Retentionsfaktor k ≥ 2 der Fall, so muss davon ausgegangen werden, dass mit der Säule etwas nicht in Ordnung ist, sie weit entfernt von uopt betrieben wird, oder die verwendete Apparatur nicht zum Betreiben der Säule geeignet ist.

Folgende Defizite sind bei einer Apparatur möglich:

  • Verbindungskapillaren sind ungeeignet (zu großer Durchmesser).
  • Fluidische Verbindungen weisen Totvolumina auf.
  • Injiziertes Probenvolumen ist zu groß oder Dispersion in Autosampler-Fluidik unangemessen.
  • Die Detektorzelle hat ein zu großes Volumen.
  • Am Detektor ist eine zu große Zeitkonstante eingestellt.

Bezüglich fluidischer Verbindungen zeigen die Thermo Scientific Viper Kapillaren mit stirnseitiger Dichtung Vorteile. Sie sind automatisch nahezu frei von Totvolumen, sobald sie per Hand dicht angezogen wurden. Das Design und Funktionsprinzip ist in Abbildung 2 gezeigt. Ebenso sieht man dort den Effekt, wie schlechte fluidische Verbindungen das Erkennen eines Schulterpeaks unmöglich machen.

Geschwindigkeitsoptimierung in der UHPLC

Am Beispiel der Trennung von vier Parabenen ist die Methodenoptimierung dazu in Abbildung 3 dargestellt. Die ursprüngliche Trennung basierte auf Anwendung einer 250 mm langen Säule mit 5-µm-Partikeln, mit einer Flussrate von 0,3 ml/min betrieben. Die Auflösung ist in diesem Fall bereits mehr als ausreichend und es besteht kein Grund, sie mit kleineren Teilchen weiter zu verbessern. Hier ist das Konzept der systematischen Geschwindigkeitsoptimierung unter Erhalt der ursprünglichen Auflösung angezeigt. Gut realisierbar ist dies, wenn Säulen in den entsprechenden Längen mit stationären Phasen der gleichen Oberflächenchemie, aber anderen Partikeldurchmessern dp zur Verfügung stehen. Die Vorgehensweise unterliegt dabei zwei einfachen Regeln:

  • Regel 1: Die Säulenlänge wird um denselben Faktor reduziert, wie der Teilchendurchmesser, L/dp bleibt also konstant.
  • Regel 2: Die Lineargeschwindigkeit u, bei konstantem Innendurchmesser gilt dies auch für die Flussrate F, wird um den Faktor erhöht, um den dp verringert wurde.

Gemäß dieser Regeln wurde zunächst die Säulenlänge von 250 mm auf 150 mm reduziert, proportional zur Reduktion des Teilchendurchmessers von 5 µm auf 3 µm. Zugleich muss die Flussrate von 0,3 ml/min auf 0,5 ml/min erhöht werden, um die Säule weiterhin im Effizienzoptimum zu betreiben. Die Zeit für die Analyse verringert sich so um Faktor 2,8, wird doch die um Faktor 1,67 kürzere Säule mit dem 1,67-fachen Fluss betrieben. Die Teilchengröße kann auch in einem Schritt von 5 µm auf 2,2 µm reduziert werden. In diesem Fall wird die Säulenlänge auf 2/5 der ursprünglichen Länge (von 250 mm auf 100 mm) reduziert und der Fluss entsprechend um Faktor 2,5 auf 0,75 ml/min erhöht. Auf diese Weise erhöht sich die Geschwindigkeit sogar um Faktor 6,25 (2,52). Der Druck wächst umgekehrt proportional zu dp2, dafür wurde aber die Säulenlänge proportional gekürzt. Bei gleichem Fluss wäre der Druck auf kurzer Säule um den Faktor gewachsen, wie dp verringert wurde. Da der Druck aber zu Fluss F proportional ist und F um den Faktor erhöht wurde, wie dp verringert wurde, kommt nun eine weitere Komponente hinzu, die den Druck auf der kürzeren Säule um den Faktor erhöht, um den dp verringert wurde. Somit hat sich sowohl der Druck als auch die Analysengeschwindigkeit um den Faktor 1/dp2 erhöht. Dies führt zu einer grundlegenden Erkenntnis: Bei Methodenbeschleunigung unter Erhalt der Auflösung ist die Analysengeschwindigkeit proportional zum Säulendruck.

Der Zusammenhang ist durch gemessene Druckwerte in Abbildung 3 bestätigt, die geringfügigen Abweichungen sind durch den Beitrag der Apparatur zu erklären. Außerdem wurde für die Anpassung von Säulenlänge und Fluss mit dp = 2 µm gerechnet, der Teilchendurchmesser im dritten Experiment betrug aber 2,2 µm.

Zur vollständigen Erklärung der systematischen Geschwindigkeitsoptimierung werden noch Gradientenparameter berücksichtigt. Zu den oben bereits erwähnten Regeln für Säulenlänge, Teilchendurchmesser und Flussrate kommen noch zwei Regeln hinzu, um das Gradientenprogramm und das Injektionsvolumen richtig anzupassen. Sie lauten bei konstantem Säulendurchmesser:

  • Die Gradientendauer tG muss um den Faktor verkürzt werden, um den die Säulenlänge verkürzt wurde und weiterhin um den Faktor, um den die Flussrate erhöht wurde. Somit ist also bei konstantem Säulendurchmesser die Gradientendauer tG proportional zu F x L (wurde alles richtig gemacht, so ergibt sich daraus zwangsläufig, dass tG proportional zu 1/dp2 ist).
  • Das Injektionsvolumen Vinj muss um denselben Faktor verringert werden, um den das Säulenvolumen verringert wird und weiterhin noch um die Quadratwurzel des Faktors, um den der Teilchendurchmesser verringert wird. Somit ist also im Falle eines konstanten Säulendurchmessers Vinj proportional zu √dp x L.

Zu Regel 1 muss beim ersten Schritt der Gradient um Faktor 2,8 verkürzt werden, beim zweiten Schritt dann um Faktor 6,2. Aus der Verkürzung der Gradientendauer tG folgt dann eine kürzere Analysenzeit. Ist die Anpassung nicht korrekt, so ändert sich auch die Analysengeschwindigkeit nicht entsprechend. Für das Injektionsvolumen müssen L und dp in verschiedenen Potenzen berücksichtigt werden und es ergibt sich zunächst ein Faktor von ca. 2, im zweiten Schritt ein Faktor von 4. Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass diese Faktoren gerundete Werte darstellen, ähnlich der Behandlung der 2,2 µm Teilchen als 2,0 µm. Die erfolgreiche Methodenbeschleunigung bestätigt den Sinn der einfachen und pragmatischen Herangehensweise.

Da es sich hier um eine Gradientenelution handelt, verändert sich der Rückdruck im Laufe der Trennung. Die in Abbildung 3 angegebenen Druckwerte gelten für die Anfangsphase der Trennung, wo die Viskosität der mobilen Phase am höchsten ist. Ausgehend von einer 400-bar-fähigen Apparatur lässt sich bei der korrekten Übertragung auf eine gleichwertig auflösende Methode unter voller Ausnutzung einer 1200-bar-Apparatur die Analysengeschwindigkeit maximal um den Faktor 3 steigern.

Es stellt sich nun die Frage, warum beim Übergang von konventioneller HPLC auf UHPLC immer wieder von Geschwindigkeitssteigerungen von Faktor 10 oder mehr gesprochen wird. Diese Angaben beruhen oft auf idealisierten Bedingungen, bei denen die Auflösung der Originalmethode so gut war, dass sie während der Optimierung reduziert werden konnte. Dazu wird dann die Säulenlänge stärker verringert als der Teilchendurchmesser, die Lineargeschwindigkeit über das H/u-Minimum gesteigert und der Gradient entsprechend steiler gemacht. Auch dies ist eine pragmatische Herangehensweise, aber eine Verletzung der Regeln birgt immer die Gefahr, dass die vollständige Trennung nicht erhalten bleibt. Bei der Weiterführung der Optimierung der Trennung aus Abbildung 3 ging dieses Konzept auf und die Geschwindigkeit ließ sich um Faktor 25 bei gerade einmal 7-fachem Druck steigern (s. Abb. 4, online).

Eine Methodenbeschleunigung wäre auch über die Erhöhung des Diffusionskoeffizienten Dm möglich. Diese kann z.B. durch Erhöhung der Temperatur erreicht werden, was drei klare Vorteile mit sich bringt:

  • Eine Säule mit gleicher Selektivität aber kleineren Partikeln und passender Länge ist nicht Bedingung.
  • Das spart die Kosten vor der Methodenübertragung, eine solche Säule anzuschaffen.
  • Die dazu verwendete Apparatur muss keine höheren Arbeitsdrücke aufbringen können.

Aber auch drei klare Nachteile:

  • Die Temperaturerhöhung verschiebt das Minimum der H/u-Kurve nach rechts und verringert den Verlust an Auflösung bei Analysengeschwindigkeiten jenseits des Kurvenminimums, erzeugt jedoch kein Minimum mit kleinerem H-Wert. Damit ist keine Verkürzung der Säulenlänge möglich. In der Praxis ergeben sich da­raus kaum höhere Beschleunigungsfaktoren als 3, während über kleine Teilchen und kurze Säulen mit der UHPLC spielend Faktoren von 10 und mehr erreicht werden können.
  • Die Veränderung der Temperatur kann auch Selektivitäten verändern und es wird sich mit Sicherheit die Retention verändern (Thermodynamik). Damit erfüllt die schnellere Trennung nicht immer die Anforderungen für die Auflösung und dieses Problem tritt an die Stelle des Findens einer entsprechenden kurzen Säule mit kleineren Teilchen.
  • Die erhöhte Temperatur wird besonders bei wasserreichen mobilen Phasen und hohem pH-Wert zur drastischen Verkürzung der Säulenlebensdauer führen. Es kann also doch günstiger sein, in eine UHPLC-Säule zu investieren und diese maximal bei 40 bis 50 °C zu betreiben, wo sie gut stabil ist.

Die Rolle der Temperatur wird in den Tipps der Fortsetzungsserie nochmals an einem Beispiel erläutert.

* Dr. F. Steiner: Thermo Fisher Scientific, 82110 Germering

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