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GC / HPLC

SPME-Headspace-Technik zur Analyse von Stoffwechselprozessen

22.09.2008 | Autor / Redakteur: Thomas Grimm*, Eike Kleine-Benne**,
Rainer Senz*** und Christian Piechotta**** / Marc Platthaus

1 Durch den Einsatz der SPME-Headspace-Analytik wird die Sensitivität um das 480-fache erhöht.
1 Durch den Einsatz der SPME-Headspace-Analytik wird die Sensitivität um das 480-fache erhöht.

Längst haben die Gas- und Hochleistungs-Flüssigchromatographie ihren Platz in der Biotechnologie gefunden. Mithilfe von GC und HPLC lassen sich in Verbindung mit der SPME-Headspace-Technik enzymatische Reaktionen sowie Stoffwechselprozesse einfach überwachen und exakt nachvollziehen und dies im Minimaßstab: in klassischen Headspace-Vials.

Im Verlauf enzymatischer und mikrobieller Reaktionen werden die Ausgangsstoffe mithilfe von Biokatalysatoren wie Enzymen, Mikroorganismen, pflanzlichen und tierischen Zellen in eine Substanz definierter chemischer Zusammensetzung umgewandelt. Die Reaktion verläuft bei zehn bis 40 °C und einem milden pH-Wert von 5 bis 9. Die Ausgangsstoffe werden regio- und enantioselektiv umgesetzt und die eventuell labilen Zielmoleküle bleiben in ihrer Struktur erhalten. Zur Detektion und Auswertung des Stoffwechsels bedarf es einer Analysentechnik, die den spezifischen Bedingungen Rechnung trägt. Dies gelingt mit der GC- beziehungsweise HPLC; beide Trenntechniken haben sich inzwischen in der bioanalytischen Praxis bewährt. Mit so genannten Chiralitäts-Säulen lassen sich die biologischen Reaktionsprodukte von den Ausgangsstoffen abtrennen.

Schwächen der derzeitigen Technik

Bei den verfügbaren Mikrotiterplatten- und Schüttlersystemen sind Reaktions- und Analyseneinheit stets voneinander getrennt. Das ist zwar bei gängigen optischen Messverfahren nicht so, allerdings ist deren Informationsgehalt bei weitem nicht vergleichbar mit dem moderner GC- oder HPLC-Systeme. Im Rahmen eines Forschungs- und Entwicklungsvorhabens hat die in Berlin ansässige Firma Bioworx, in Zusammenarbeit mit dem Chromatographie-Spezialisten Gerstel aus Mülheim an der Ruhr sowie mit erfahrenen Anwendern, das Gerstel-MPS-Bioscreen entwickelt. Hierbei handelt es sich um ein leistungsfähiges System für das Screening biologischer Anwendungen. In kleinen Testansätzen lassen sich eine große Anzahl unterschiedlicher biochemischer Vorgänge untersuchen und schnell Ergebnisse über deren Umsetzung voll automatisiert produzieren.

Fragen zum Versuchsaufbau

Das Reaktionssystem sollte über ein Reaktionsgefäß verfügen, das sterilisier- und verschließbar ist. Es sollte von einer Größe sein, die eine Einpassung in gängige Autosampler, eine möglichst effiziente Handhabung sowie einen hohen Probendurchsatz möglich macht. Die Probe sollte sich aufgrund des homogenen aeroben mikrobiellen Wachstums gut durchmischen und sich sowohl luftdicht als auch luftdurchlässig verschließen lassen. Wie sich im Verlauf zeigte, ermöglicht es die GC, die Reaktionskinetik laufender biologischer Prozesse einfach zu überwachen und zu analysieren und zwar in GC-Headspace-Vials (HS-Vials). Es stellte sich auch heraus, dass es durch Modifikation des Vialdeckels gelingt, aerobe und anaerobe biologische Prozesse zu etablieren und reproduzierbare Reaktionen mit einem Volumen von 1 bis 15 mL zu realisieren. Um nun das Prozedere nebst Chromatographie und Detektion möglichst automatisiert durchführen zu können, musste ein Autosampler zum Einsatz kommen, der sich entsprechend flexibel einsetzen lässt. Verwendet wurde der Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS), ein XYZ-Laborroboter für die GC und LC, der seine Bewegungen frei programmierbar in alle drei Raumrichtungen ausführt.

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