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Güte einer UHPLC-Trennung Strategie zum Screenen von UHPLC-Säulen

Autor / Redakteur: Hans-Werner Bilke* und Andreas Orth** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Wovon hängt die Güte einer UHPLC-Trennung ab? Lesen Sie, wie eine auf QbD-Prinzipien basierende Methode zur Beurteilung der Güte herangezogen werden kann, die neben der Auflösung des kritischen Peakpaares auch die Robustheit der Trennung betrachtet.

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Abb.1: Empirisches Prozessmodell mit den Einflussgrößen Gradientenzeit tG, Temperatur T, Startkonzentration Eluent B%, Endkonzentration Eluent B%, pH wässriger Eluent A, Flussrate F und den Zielgrößen, Auflösung mehrerer Peakpaare sowie minimale Analysenzeit.
Abb.1: Empirisches Prozessmodell mit den Einflussgrößen Gradientenzeit tG, Temperatur T, Startkonzentration Eluent B%, Endkonzentration Eluent B%, pH wässriger Eluent A, Flussrate F und den Zielgrößen, Auflösung mehrerer Peakpaare sowie minimale Analysenzeit.
(Bild: LC-Pharm-HPLC-Expert Service)

[Am Ende des Artikels können Sie sich eine ausführliche Ausarbeitung zu diesem Thema herunterladen.]

Die Qualität eines flüssigchromatographischen Trennprozesses hängt von einer Vielzahl von Faktoren und Zielgrößen ab. In der pharmazeutischen Analytik von kleinen Molekülen können je nach Molekül für die UHPLC-Trennungsoptimierung bis zu zehn Faktoren sowie deren Wechselwirkungen signifikant sein. Solche Faktoren sind zu suchen in der Gradientenzeit (tG), der Temperatur (T), der ternären Eluentzusammensetzung (tC) des organischen Eluenten B, der Startkonzentration (%Bs) und Endkonzentration (%Be) des organischen Eluenten B, dem pH des wässrigen Eluenten A (pH) sowie der Flussrate (F). Nicht zu vergessen ist natürlich die stationäre Phase der Trennsäule selbst als wichtige Einflussgröße. Zielgrößen sind zu sehen in der kritischen Auflösung Rs,krit. (Auflösung für das am schlechtesten getrennte Peakpaar im Chromatogramm) für die optimale UHPL-Trennung sowie in der Retentionszeit des letzten Peaks im Chromatogramm tRmax. zur Minimierung der Analysenzeit. Die Minimierung der Analysenzeit von Routinemethoden bietet ein erhebliches Potenzial zur Steigerung des Durchsatzes und der Produktivität im UHPLC-Analysenlabor.

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Kommerziell erhältliche Software zur Computer-unterstützten UHPLC-Methodenentwicklung (CMD) wie etwa Drylab (Molnar-Institut für angewandte Chromatographie) oder Chromsword (VWR International) unterliegen den Einschränkungen einer maximal 3-Faktor-Optimierung sowie der Modellierung mit nur einer Zielgröße (Auflösung des kritischen Peakpaares). Es wird am „globalen Optimum“ vorbei optimiert [1], ohne dass eine Diagnostik oder auch nur eine Strategie existiert, um dies zu erkennen und zu verbessern.

Ein mehr als drei Methodenparameter sowie mehr als eine Zielgröße umfassendes Screenen einer UHPLC-Trennung ist durch Verknüpfung der sehr effektiven Arbeitsweisen von Computer-unterstützter UHPLC-Trennoptimierung (chromatographische Modellierungssoftware z.B. Drylab 4) und statistischer Versuchsplanung (statistische DoE-Software z.B. Modde 11 Pro) realisierbar [2].

Experimentelles

Die Versuche wurden von Robert Kormany (Egis Pharmaceuticals) und Imre Molnar und H.-J. Rieger (Molnar Institut) durchgeführt. Die Versuchsparameter waren:

  • Säule: UHPLC-Säulen der Dimension 50 x 2,1 mm mit 2-µm-Partikel.
  • Eluent: Die mobile Phase war eine Mischung von Acetonitril und 5 mM Ammoniumdihydrogenphospat-Puffer. Der Analyt enthält 10 µg/ml Amlodipin und seine Ph.Eur.-Verunreinigungen (A, B, D, E, F, G und H), gelöst in Acetonitril:Wasser (30:70)(V/V)).

Für neun unterschiedliche UHPLC-Säulen wurden jeweils vier chromatographische Trennungen (linearer Gradient 30 - 90%B, Gradientenzeit 3 min und 9 min, Temperatur 15 °C und 45 °C) bei drei verschiedenen pH-Werten (2,0, 2,5, 3,0) des phosphatpufferhaltigen Eluenten A auf einem Shimadzu LC-2010C (Verweilvolumen 1,06 ml) ausgeführt. Detektiert wurde bei 254 nm. Das Injektions-Volumen betrug 1 µl [3].

Empirisches Prozessmodell

Ableitend aus den Rohdaten dieser 3-Faktor-Optimierung (zur Verfügung gestellt vom Molnar-Institut für Chromatographie), wurde für die simultane Optimierung aller signifikanten UHPLC-Methodenparameter jeweils ein empirisches Prozessmodell (s. Abb. 1) [4, 5] mit sechs Faktoren und mehreren Zielgrößen für drei UHPLC-Säulen aufgestellt, abgearbeitet und visualisiert. Zum robusten Screenen wurde die sehr effiziente Arbeitsweise der statistischen Versuchsplanung (DoE) benutzt. Basierend auf den Ergebnissen der statistischen Versuchsplanung wird ein empirisches, statistisch abgesichertes Prozessmodell erstellt und nach Modell-Überprüfung mit einfachen statistischen Diagnosen (Residuenanalysen) ein Screening durchgeführt. Dabei treten häufig Zielkonflikte auf. Einstellungen der Faktoren, die für eine Zielgröße günstig sind, können für andere Zielgrößen ungünstig sein. Um robust zu screenen, ist also ein Multi-Zielgrößen-Modell notwendig [6]. Den Bereich, den alle Faktoren von ihrer minimalen bis zu maximalen Einstellung abdecken, nennt man Versuchsraum, im Kontext von QbD auch Knowledge Space. Er ist i.d.R. wesentlich größer als der anschließend zu bestimmende Design Space [7]. Meist benötigt man mehrere Zielgrößen, um alle Ziele einer Versuchsreihe abzubilden. Die Auflösung des kritischen Peakpaares wird auch heute noch als alleinige Zielgröße einer UHPLC-Trennung angesehen [8].

Versuchsplan zum Screening

Design of Experiments und Quality-by-Design-Analyse sind tatsächlich der effektivste Ansatz um eine Modellierung aller signifikanten Faktoren und Zielgrößen einer UHPLC-Trennung zu erreichen [9]. Ein Problem ist, dass bei Optimieren der UHPLC-Trennung durch die erforderliche Variation der Versuchsbedingungen eine Umkehr der ursprünglichen Peakreihenfolge für Peakpaare auftritt. Wenn Änderungen in der Elutionsreihenfolge der Peaks auftreten, verweist die Literatur [10] auf zwei Einwände gegen eine Modellierung der Auflösung als Zielgröße:

  • 1. Zwei Peaks A und B ändern ihre Elutionsreihenfolge einmal als AB und einmal als BA. Um zwischen beiden Situationen zu unterscheiden, sollte man eine der beiden Auflösungen ein negatives Vorzeichen geben (z.B. Rs(AB) = 1,5 und Rs(BA) = -1,5).
  • 2. Innerhalb der Experimente des Versuchsplans treten infolge der geänderten Versuchsbedingungen unterschiedliche Peakpaare als das kritische Peakpaar auf. Der erste Einwand ist auf eine ungeschickte Handhabung der DoE-Methodik zurückzuführen. Kehrt man bei Peakumkehr einfach das Vorzeichen der Auflösung um, so verwendet man implizit die Funktion „Absolutbetrag“, die bei Null eine Spitze hat. Praktisch bedeutet das, dass man die Absolutfunktion gar nicht – auch nicht implizit – verwendet, sondern negative Auflösungen zulässt und „Auflösung > Grenzauflösung“ als gleichwertig mit „Negativauflösungen < minus Grenzwert“ betrachtet. Bezogen auf die Qualität der Trennung sind beide Forderungen absolut gleichwertig.

Der zweite Einwand ist tatsächlich eines der stärksten Argumente für die Verwendung der Versuchsplanung. Wird für alle Peakpaare derselbe Modelltyp verwendet, so ist für alle Peakpaare auch der Versuchsplan derselbe. Die Verwendung der vorzeichenbehafteten Auflösung in einer Mehrzieloptimierung dient zum Definieren eines Design Space als Bereich mit sicherem Abstand zu den Umkehrpunkten.

Da die Schätzung von Wechselwirkungen zwischen den Faktoren und ihren Einfluss auf die Zielgrößen beim Screenen einer UHPLC-Trennung sehr wichtig ist, wurde hier ein Rechtschaffner-Versuchsplan (s. Online-Variante des Beitrags auf www.laborpraxis.de) mit 37 Versuchen verwendet. Rechtschaffner-Pläne sind nicht ganz ausbalancierte und deshalb nur fast orthogonale, gesättigte Fraktionen der Auflösung V eines 2n oder 3n faktoriellen Designs. Sie erlauben die Schätzung aller Haupteffekte sowie aller erster Ordnung-Wechselwirkungen ohne Vermengung und unterstützen wie in unserem Fall auch die Verwendung quadratischer Terme.

Resultate und Diskussion

Die Ergebnisse der DoE-Experimente für die Zielgrößen Rs und tRmax. sind in den Rohdaten-Plots (s. Online-Variante des Beitrags auf www.laborpraxis.de) dargestellt. Besonders zu beachten sind die Auflösungswerte der Peakpaare 1/2, 5/6 und 6/7. Für diese Peakpaare ist durch die erforderliche Variation der Versuchsbedingungen eine Umkehr der ursprünglichen Peakreihenfolge zu beobachten, d.h. negative Auflösungs-Werte sind die Folge. Für die Triart-Säule ist es das Peakpaar 6/7, für die Kinetex-XB-C18-Säule sind es die Peakpaare 5/6 und 6/7 und für die Acquity-BEH-C18-Säule die Peakpaare 1/2, 5/6 und 6/7 (Appendix). Neben der Elutionsreihenfolge ändert sich auch das kritische Peakpaar in Abhängigkeit von der jeweiligen Faktoreinstellung der Versuchsplanexperimente.

Robuste Optimierung

Noch heute wird die Berechnung des optimalen Arbeitspunkt (Finden einer Lösung so nahe wie möglich am Ziel) in kommerziell erhältlicher Software zur Computer-unterstützten UHPLC-Methodenentwicklung (CMD) in der Modellierung benutzt [11, 12, 13]. Die Findung des robusten (globalen) Arbeitspunktes (s. Tab. 1) hingegen erlaubt die maximale Variation der Faktoren innerhalb des Design Space unter Einhaltung der Spezifikation(en) der UHPLC-Trennung. Darüber hinaus wird die sich daraus ableitende Robustheit (s. Abb. 2) der UHPLC-Trennung für jeden Säulentyp ermittelt. Für alle drei UHPLC-Säulen werden ähnliche robuste Arbeitspunkte berechnet. Die Zielgrößen-Spezifikation (-1,5 ≥ –Rs,krit. oder Rs,krit. ≥ 1,5) wird für alle Säulentypen eingehalten.

Werden für die Güte der UHPL-Säulen nur die Auflösung des kritischen Peakpaares Rs,krit und die Retentionszeit tRmax. für den letzten Peak der Säule berücksichtigt, so ist die Kinetex-XB-C18-Säule die geeignetste Trennsäule (ausreichende Auflösung für das kritische Peakpaar, kürzeste Analysenzeit) für die Routineanalytik.

Robustheit der HPLC-Trennung

Aussagen, dass neben der Auflösung des kritischen Peakpaares als Gütekriterium der UHPLC-Trennung auch die Robustheit der Trennung zu beachten ist, liegen bereits nahezu 25 Jahre vor [14]. Im Mittelpunkt des QbD-Ansatzes zur Robustheitsaussage einer UHPLC-Trennung steht die Schätzung eines Design Space [15]. Mit dem Design Space Hypercube, dem größtmöglichen regelmäßigen Hyperwürfel im unregelmäßigen Design-Space-
Volumen (gestrichelt umrahmte Fläche), werden die Ergebnisse der robusten Multi-Faktoren-/Multi-Zielgrößen-Optimierung im zweidimensionalen Design Space Plot tG-T (Faktoren mit stärkstem Einfluss
auf die HPLC-Trennung) visualisiert (s. Abb. 2).

Wie aus der Abbildung ableitbar, weist die Triart-C18-Säule für die UHPLC-Trennung die größte Fläche des Design Space Hypercube im experimentellen Bereich auf, d.h. die UHPLC-Trennung auf der Triart-C18-Säule ist am robustesten. Für die UHPLC-Trennung auf der Acquity-BHE-C18-Säule wird kleinste Fläche des Design Space Hypercube und somit die geringste Robustheit ausgewiesen. Diese Tatsache wird in den 4D Design Space Plots (s. Abb. 3) der wichtigsten Faktoren T, %Bs, tG, F durch die Größe der grünen Flächen als grafische Darstellung der Robustheit belegt und in den aus den Design Space Hypercube ableitbaren Toleranzgrenzen (low edge, high edge) für jeden Faktor (s. Tab. 2) festgeschrieben.

Aus der Abbildung 3 ist ableitbar, dass für die Triart-C18-Säule die größte grüne Fläche (Fehlerwahrscheinlichkeit von 1%) im Design Space Plot gefunden wird, d.h. die Trennung ist am robustesten. Weniger robust ist die UHPLC-Trennung auf der Kinetex-XB-C18-Säule. Am wenigsten robust (keine grüne Fläche) ist die UHPLC-Trennung auf der Acquity-BHE-C18-Phase. Mit den Design Space Hypercube „low- und high edge“-Werten werden die maximal möglichen Toleranzen für die Faktoren (s. Tab. 2) der UHPLC-Trennung gefunden.

Für die UHPLC-Trennung mit der Triart-C18-Säule werden die breitesten Faktorbereiche, d.h. die maximal möglichen Toleranzen für jeden einzelnen Faktor (Veränderungen der Faktoreinstellung innerhalb des Design Space unter Einhaltung der Zielgrößen-Spezifikationen), ausgewiesen. Die Faktor-Einstellungen (PAR) dürfen mit einem eingestellten Fehlerrisiko von 1% innerhalb dieser Toleranzen verändert werden, ohne die Qualität der UHPLC-Trennung (-1,5 ≥ –Rs,krit. oder Rs,krit. ≥ 1,5) zu gefährden.

Kontrolle der UHPLC-Trennung

Die nachfolgenden Chromatogramme am robusten Arbeitspunkt sowie an den Design-Space-Hypercube-Eckpunkten niedrig und hoch illustrieren am Beispiel der Triart-C18-Säule die getätigten Aussagen zur Güte der UHPLC-Trennung. An allen drei Punkten des Design Space Hypercube wird die Zielgrößenspezifikationen (-1,5 ≥ –Rs,krit. oder Rs,krit. ≥ 1,5) eingehalten.

Werden für die Güte der UHPL-Säulen nur die Auflösung des kritischen Peakpaares Rs,krit. und die Retentionszeit tRmax. für den letzten Peak der Säule berücksichtigt, so ist für die Routineanalytik die Acquity-BEH-C18-Säule die am geeignetste Trennsäule (beste Auflösung für das kritische Peakpaar, kürzeste Analysenzeit). Wird zusätzlich noch die Robustheit der UHPLC-Trennung zur Beurteilung der Güte der Trennung herangezogen so ist die Acquity BEH C18 die am wenigsten geeignete Trennsäule und die Triart C18 die geeignetste Trennsäule für die Routineanalytik!

Nur das simultane Betrachten aller signifikanten Faktoren sowie die Wahl von mehr als nur einer Auflösung (z.B. Auflösung des kritischen Peakpaares Rs,krit.) als Zielgröße führt unter Berücksichtigung der Robustheit der UHPLC-Trennung zu eindeutigen Aussagen hinsichtlich der Güte der UHPLC-Trennung und ist somit zielführend hinsichtlich der Auswahl der am besten geeigneten UHPLC-Säule für eine effiziente und robuste Trennung unter Einhaltung der Zielgrößenspezifikationen (-1,5 ≥ –Rs,krit. oder Rs,krit. ≥ 1,5).

Zusammenfassung: Es wird eine strukturierte Methodik zur Beurteilung der Güte einer UHPLC-Trennung vorgestellt. Neben der Auflösung des kritischen Peakpaares wird auch die Robustheit zur Beurteilung der Güte der Trennung herangezogen. Nur durch die Angabe des robusten Arbeitspunkts, der bewährten Faktorbereiche (PAR) und der Auflösung für das kritische Peakpaar wird die UHPLC-Trennung hinreichend charakterisiert. Nur dann kann man argumentieren, dass solange lediglich Änderungen von Faktoreinstellungen innerhalb bewährter Faktorbereiche erfolgen, kein Bedarf an einer Revalidierung der UHPLC-Trennung besteht.

Literatur

[1] M. Pfeffer. in HPLC richtig optimiert: Ein Handbuch für Praktiker. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim 2006. 627-650.

[2] H.W. Bilke und S. Moser, Quality by Design in der HPLC, Laborpraxis 4 (2013), 50-52.

[3] R. Kormany, I. Molnar, H.-J. Rieger, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 80 (2013) 79-88

[4] Th.Wember, „Technische Statistik und statistische Versuchsplanung“, (Eigenverlag als Kursunterlagen, (2006).

[5] H.W. Bilke und S. Moser, Quality by Design in der HPLC, LABORPRAXIS 7/8-2014.

[6] Taschenbuch Versuchsplanung: „Praxisreihe Qualitätswissen“, Wilhelm Kleppmann, Hanser Verlag, 2008, 253, 323 Seiten.

[7] S. Soravia, A. Orth: Design of Experiments (DoE), Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry – Release 2001/2007, Wiley-VCH Verlag, Weinheim (2001/2007), ebenfalls erschienen in Ullmann’s Modelling and Simulation, Wiley-VCH (2007)

[8] S. Kromidas, HPLC -ipp im September 2012

[9] L. Eriksson et.al., “Design of Experiments: Principles and Applications”, MKS Umetrics AB, 2008, Third revised and enlarged edition, S.188-194, 202.

[10] Y. Vander Heyden, “Common Problems with Method Optimization in pharmaceutical Analysis”, LCGC Europe, 24(8), 423 (2011).

[11] I. Molnár, H.-J. Rieger, K.E. Monks, Aspects of the “Design Space” in High Pressure Liquid Chromatography Method Development, J. Chromatogr. A 1217, 3193-3200 (2010).

[12] I. Molnár, H.-J. Rieger, R. Kormány, Chromatography Modelling in High Performance Liquid Chromatography Method Development, Chromatography Today, 1, 3-8 (2013)

[13] E.F. Hewitt, P. Lukulay, S.J. Galushko, J. Chromatogr. A , 1107, (2006) 79

[14] V. M-Meyer, Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie, 7. Auflage 1992, Otto Salle Verlag GmbH & Co., Frankfurt am Main, Verlag Sauerländer AG Aarau Schweiz 1979

[15] C. Vikström “Robust Optimization”, MKS Umetrics AB, IFPAC presentation (2014).

* Dr. H.-W. Bilke: LC-Pharm-HPLC-Expert Service, 83098 Brannenburg, Tel. +49-8034-6079305

* *Prof. A. Orth: Frankfurt University of Applied Sciences, 60318 Frankfurt a.M.

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