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Fluoreszenzmikroskopie Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie zellulärer Strukturen

Autor / Redakteur: Mike Heilemann* und Markus Sauer** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht faszinierende Einblicke in die Organisation und Struktur lebender Zellen und Zellverbände. Aufgrund der Wellennatur des Lichts ist die Auflösung jedoch auf einige hundert Nanometer beschränkt. Eine neue Methode erlaubt es nun, zelluläre Strukturen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu beobachten.

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1 Prinzipieller Aufbau eines dSTORM Mikroskops: Das Anregungslicht eines Lasers (blau) wird durch ein Objektiv auf eine Probe geleitet, und auf diese Weise Farbstoffe zur Aussendung von Fluoreszenzlicht angeregt (orange). Das Fluoreszenzsignal einzelner Moleküle wird mit hochempfindlichen CCD-Kameras detektiert. Bilder: Uni Würzburg
1 Prinzipieller Aufbau eines dSTORM Mikroskops: Das Anregungslicht eines Lasers (blau) wird durch ein Objektiv auf eine Probe geleitet, und auf diese Weise Farbstoffe zur Aussendung von Fluoreszenzlicht angeregt (orange). Das Fluoreszenzsignal einzelner Moleküle wird mit hochempfindlichen CCD-Kameras detektiert. Bilder: Uni Würzburg
( Archiv: Vogel Business Media )

Die Fluoreszenzmikroskopie wird bereits seit vielen Jahren in der Biologie und Medizin zur Visualisierung und zum Studium der Interaktionen zellulärer Bestandteile und Strukturen erfolgreich eingesetzt. Hierbei werden die einzelnen Zellbestandteile, meistens Proteine, selektiv mit fluoreszenzmarkierten Liganden (z.B. Phalloidin für Aktin), Antikörpern (Immunfluoreszenz) oder durch Fusion mit einem fluoreszierenden Protein markiert. In fluoreszenzmikroskopischen Bildern lässt sich anschließend die Position oder die Bewegung der Signale im Cytoplasma oder im Nukleus bestimmen. Heute existiert eine breite Palette an Fluoreszenzfarbstoffen, Markierungsmethoden und Mikroskopiemethoden, deren Auflösung jedoch aufgrund der Beugung der Lichtwellen auf etwa die Hälfte der Wellenlänge des verwendeten Lichts, d.h. typischerweise auf ca. 200 bis 300 Nanometer, beschränkt ist. Hierdurch gehen wichtige Details, die für das Verständnis zellulärer Prozesse von ausschlaggebender Bedeutung sind, verloren. Einblicke in die Zusammensetzung lebenswichtiger molekularer Proteinkomplexe mit einer Größe von wenigen zehn Nanometern, d.h. mit einer Größe weit unterhalb der Beugungsgrenze, bleiben allerdings verwehrt.

Zur Überwindung der Auflösungsgrenze kann man sich eines einfachen Tricks bedienen: die präzise Bestimmung der exakten Position einzelner Farbstoffmoleküle. Ein Fluoreszenzmikroskop sammelt das Fluoreszenzlicht der Farbstoffe und bildet das Signal als Lichtfleck auf einem Detektor ab (s. Abb. 1). Hierbei wird das Signal selbst eines einzelnen leuchtenden Moleküls mit einer Größe von wenigen Nanometern aufgrund der Beugung in einem Lichtfleck mit einer Größe von einigen hundert Nanometern (entsprechend etwa der hal-ben Wellenlänge λ des Lichts) abgebildet (s. Abb. 2). Wenn die gemessene Abbildungsfunktion von einem einzelnen Farbstoff stammt, kann sie mithilfe einer Gaußfunktion angepasst und die genaue Position des Moleküls aus der Funktion bestimmt werden (s. Abb. 2). Die Genauigkeit hängt hauptsächlich von der Signalintensität ab, d.h. der Zahl der detektierten Photonen, und gelingt unter Standardbedingungen mit einem Fehler von wenigen Nanometern. Mit diesem Trick ist es möglich, die Position eines einzelnen Moleküls auf wenige Nanometer genau zu bestimmen, auch wenn aufgrund der Beugung eine deutlich breitere Abbildungsfunktion beobachtet wird.

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Kontrolle der Fluoreszenz einzelner Farbstoffmoleküle

Befinden sich nun zwei oder mehr Farbstoffmoleküle in einem Abstand, der kleiner als die Auflösungsgrenze von λ/2 ist, so überlappen ihre Punktabbildungsfunktionen und können nicht mehr getrennt angepasst werden. In dem verschwommenen Bild geht ein erheblicher Teil der Strukturinformation verloren. Eine Erhöhung der räumlichen Auflösung gelingt in diesem Fall, wenn die Fluoreszenzfarbstoffe, die in ihrer Gesamtheit ein Bild darstellen, nicht gleichzeitig sondern zeitlich getrennt leuchten und ihre genaue Position so individuell bestimmt werden kann. Dabei muss darauf geachtet werden, dass gleichzeitig nur Farbstoffe fluoreszieren, die weiter als das Beugungslimit (~ λ/2) voneinander entfernt sind und somit als einzelne Moleküle erkannt werden können.

Ein anschauliches Beispiel: Wenn man eine Metropole wie London bei Nacht aus der Raumstation ISS betrachtet, erscheint die Stadt als leuchtender verschwommener Fleck. Die einzelnen Straßenzüge, Plätze und Gebäude können nicht mehr aufgelöst werden, weil die Abbildungsfunktionen der verschiedenen Signale in der Bildebene der Kamera oder des Auges in einer Entfernung von ca. 350 km überlappen. Einer ähnlichen Situation steht man bei der Fluoreszenzmikroskopie zellulärer Strukturen gegenüber. Würde jede Lichtquelle in London einzeln und für eine kurze Zeit angeschaltet, so könnte die Position jeder Lichtquelle aus der Punktabbildungsfunktion genau bestimmt werden. Nachdem alle Lichtsignale lokalisiert wurden, kann ein genaueres Bild der räumlichen Anordnungen der Lichtsignale und damit der Straßenzüge, Plätze und Gebäude etc. rekonstruiert werden, als es möglich wäre, wenn alle gleichzeitig leuchten. Der Prozess des An- und Ausschaltens sowie der exakten Lokalisation der Lichtsignale muss sehr schnell erfolgen, da ansonsten das rekonstruierte Bild aufgrund der Geschwindigkeit der ISS verwaschen wird.

In der Fluoreszenzmikroskopie gelingt dies mit optisch schaltbaren Farbstoffen: Bestrahlt man diese mit Licht einer geeigneten Wellenlänge, so werden, die meisten von ihnen ausgeschaltet (s. Abb. 3). Nur einige wenige Farbstoffe verbleiben in ihrem fluoreszierenden Zustand. Ihre Position wird exakt bestimmt, und auch sie werden mit Licht wieder ausgeschaltet, bevor der nächste Zyklus beginnt, in dem wieder einige andere Schalter statistisch durch Bestrahlung mit Licht einer anderen Wellenlänge in ihre fluoreszierende Form überführt werden. Zur exakten Positionsbestimmung einzelner fluoreszierender Schalter werden die Zentren der detektierten Punkt-abbildungsfunktionen (engl. point spread function, PSF) der einzelnen Farbstoffe mithilfe einer mathematischen Anpassung (2D-Gaußfunktion) in Abhängigkeit von der Photonenausbeute (Statistik) bestimmt. Damit wird die genaue Position der Farbstoffmoleküle bestimmt. Dieser Prozess der Lokalisation wird mehrere tausendmal wiederholt, und schließlich wird aus allen Koordinaten einzelner Moleküle ein Bild rekonstruiert (s. Abb. 3). Hierdurch kann man die Beugungsgrenze auf einfache Art und Weise mit kommerziell erhältlichen organischen Farbstoffen oder damit markierter Sonden umgehen und dSTORM-Bilder (direct stochastic optical reconstruction microscopy) mit einer optischen Auflösung von weniger als 20 Nanometern unter Routinebedingungen erhalten [1 – 3] (s. Abb. 4). Die Methode ist der photoactivated-localization microscopy (PALM) sehr ähnlich, bei der photoaktivierbare fluoreszierende Proteine verwendet werden [4]. Da die Farbstoffe reversibel schaltbar sind und die Schaltraten durch die Anregungsleistung einstellbar sind, können jedoch auch schnellere dynamische Prozesse verfolgt werden [5].

Anwendung: dSTORM in lebenden Zellen

Im Gegensatz zu einer Vielzahl unterschiedlicher photoaktivierbarer fluoreszierender Proteine standen bisher nur wenige optisch schaltbare organische Farbstoffe zur Verfügung. Angetrieben durch die große Bedeutung der super-aufgelösten Fluoreszenzmikroskopie für die Biologie und Medizin wurde die Methode weiterentwickelt, sodass es gelingt, die meisten kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffe als Photoschalter einzusetzen. Fluoresceine, Rhodamine und Oxazine können reversibel und hocheffizient zwischen einem fluoreszierenden „An-Zustand“ und einem nicht fluoreszierenden „Aus-Zustand“ durch Bestrahlung mit Licht von nur einer Wellenlänge und unter physiologischen Bedingungen geschalten werden (s. Abb. 5). Die Methode basiert darauf, dass sich die meisten im sichtbaren Spektralbereich absorbierenden und fluoreszierenden Farbstoffe in Gegenwart millimolarer Konzentrationen reduzierender Thiolverbindungen wie Mercaptoethylamin (Cysteamin) oder Dithiothereitol (DTT) durch einen licht-induzierten Prozess in einen sehr stabilen Aus-Zustand überführen lassen. Der An-Zustand wird durch Oxidation mit molekularem Sauerstoff (der in einer Konzentration von ca. 250 µM bei Raumtemperatur in Wasser gelöst ist) wieder bevölkert. Die einfache Erzeugung und Stabilität des Aus-Zustandes ist für die Methode von ausschlaggebender Bedeutung, da es nur so gelingt, dass die Mehrzahl der Farbstoffe zu jeder Zeit im Aus-Zustand verweilt und nur so eine Subpopulation weniger einzelner Farbstoffe „aktiv“ (im An-Zustand) ist. Ein entscheidender Vorteil der Methode liegt in der Tatsache, dass Zellen ebenso ein antioxidatives Schutzsystem basierend auf Glutathion (ein thiolhaltiges Reduktionsmittel) und einigen Enzymen besitzen. Somit können die meisten Fluoreszenzfarbstoffe unter zellulären Bedingungen ebenso für die superauflösende Mikroskopie nach dem hier vorgestellten Prinzip eingesetzt werden [3]. Die Methode erlaubt es, auf einfache Art und Weise superaufgelöste Fluoreszenzbilder mit konventionellen Farbstoffen im sichtbaren Bereich von ca. 480 – 700 nm unter physiologischen Bedingungen zu erzeugen. Andererseits kann dSTORM an jedem Standard-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop zur Beobachtung selbst lebender Zellen mit einer Auflösung von etwa 20 Nanometer realisiert werden [3]. Methoden der Superauflösung werden bereits von verschiedenen Anbietern kommerzialisiert. Verbesserungen in der räumlichen und zeitlichen Auflösung sowie eine Erweiterung zur vorgestellten Methode werden derzeit entwickelt und erlauben damit in naher Zukunft die superaufgelöste Verfolgung der Dynamik zellulärer Strukturen.?

Literatur

[1] Heilemann, M., S. van de Linde, M. Schüttpelz, R. Kasper, B. Sefeldt, A. Mukherjee, P. Tinnefeld, and M. Sauer, Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew. Chem. Int. Ed., 2008. 47: p. 6266-71.

[2] Heilemann, M., P. Dedecker, J. Hofkens, and M. Sauer, Photoswitches: key molecules for subdiffraction-resolution fluorescence imaging and molecular quantification. Laser & Photonics Reviews, 2009. 3: p. 180-202.

[3] Heilemann, M., S. van de Linde, A. Mukherjee, and M. Sauer, Super-resolution imaging with small organic fluorophores, Angew. Chem. Int. Ed., 2009. 48: p. 6903-8.

[4] Betzig, E., G.H. Patterson, R. Sougrat, O.W. Lindwasser, S. Olenych, J.S. Bonifacino, M.W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, and H.F. Hess, Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution, Science, 2006. 313; p. 1642-45.

[5] Endesfelder, U., S. van de Linde, S. Wolter, M. Sauer, and M. Heilemann, Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy of myosin-actin motility, ChemPhysChem, 2010. 11: p.8836-40.

*Lehrstuhl für Angewandte Laserphysik & Laserspektroskopie, Universität Bielefeld, 33615 Bielefeleld

**Lehrstuhl für Biotechnologie & Biophysik, Biozentrum, Julius-Maximilians-Universität Würzburg, 97074 Würzburg

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