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Alternative zu Tierversuchen Testung mithilfe von Zell-basierten Lab-on-a-Chip-Systemen

Autor / Redakteur: Karl-Heinz Feller* und Ute Hofmann** / Dr. Ilka Ottleben

Nicht zuletzt seit der EU-Verordnung über Tierversuche, die seit 2009 den Einsatz von Tieren für die Testung von Kosmetika-Rohstoffen verbietet, sind alternative Verfahren gefragt. Zell-basierte Lab-on-a-Chip-Systeme bieten hier einen vielversprechenden Ansatz.

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Abb. 1: Schema des Gesamtaufbaus des Lab-on-a-Chip-Systems zur Messung der Zellstress-Belastung von HaCaT-Zellen ... (Ausschnitt)
Abb. 1: Schema des Gesamtaufbaus des Lab-on-a-Chip-Systems zur Messung der Zellstress-Belastung von HaCaT-Zellen ... (Ausschnitt)
(Bild: Ernst-Abbe-Hochschule Jena)

Die Testung von neuen Einsatzstoffen für die Kosmetikbranche, aber auch die Verwendung von alltäglichen Chemikalien in Haushalt und Alltag stellt eine immer größere Herausforderung dar. Aufgrund der EU-Verordnung über Tierversuche, dürfen diese seit 2009 nicht mehr für Testungen von Kosmetika-Rohstoffen herangezogen werden. Weiterhin fordert die Europäische Chemikalienverordnung zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH) eine genaue Risikobewertung der Wirkung von Chemikalien auf Mensch und Umwelt. Geeignete Alternativen zu Tierversuchen sind also dringend erforderlich.

Ziel der hier vorgestellten Arbeit war die Entwicklung eines schnellen und einfachen In-vitro-Testsystems zur Bewertung der toxikologischen Verträglichkeit von Pflanzenextrakten bzw. chemischen Substanzen auf humane Hautzellen (Zelllinie: HaCaT). Im Unterschied zu den bisher existierenden Tests, die im wesentlichen Endpunktverfahren sind und damit nur eine Aussage über den eingetretenen Zelltod erlauben, wurde hier ein Verfahren entwickelt, bei dem zu jeder beliebigen Zeit eine Stress-Wirkung in Form einer Hautreizung auf die Zellen analysiert werden kann (s. Abb. 1 für das Lab-on-a-Chip-Konzept). Hierbei sollte u. a. die Unterscheidung der zellschädigenden Wirkung nach der Stärke der Stressbelastung erfolgen. Zum einen führt eine starke Belastung zum Absterben der Zellen (Apoptose), während der hier relevante Fall einer leichten Stressbelastung zum Reiz- bzw. Stresszustand der Zelle führt. Bei extrem geringen Belastungen kann es auch dazu führen, dass überhaupt keine Veränderungen der Zelle nachweisbar sind. Auf dieser Grundlage wurde die Entwicklung eines schnellen Verfahrens auf Basis eines Lab-on-a-Chip-Systems unter Einsatz früher Biomarker angestrebt.

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Etablierung des fluoreszenzbasierten Assays

Zur Etablierung des Assays war es als erstes notwendig, einen universellen Biomarker zum Nachweis von Stressreaktionen zu identifizieren. Es zeigte sich, dass Hitzeschockproteine (HSP) in der Signalkaskade der Zellen geeignete frühe Biomarker sind. Dazu wurden insgesamt drei als besonders effektiv erscheinende HSPs auf ihre Wirkung untersucht. In einem ersten Durchlauf erwies sich das HSP 72 mit einer ca. 20-fachen Erhöhung des relativen mRNA-Niveaus bei Inkubation mit CdCl2 als ausreichend empfindlicher Stress-Indikator. Ursache dafür ist die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) innerhalb der Signalkaskade in den Zellen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Sensorzelllinie aus HaCaT-Zellen, die stabil mit dem Plasmid pHSP72p-AcGFP transfiziert wurde, hergestellt. Dieses Konstrukt ist mit der Expression von grün fluoreszierenden Proteinen (GFP) unter Einfluss des HSP72-Promoters verbunden. Unter Stressbelastung zeigen die modifizierten HaCaT-Zellen ein grünes Fluoreszenzsignal, dessen Intensität eine Aussage zur Höhe/Stärke der Stress-Belastung ermöglicht (s. Abb. 2).

Von CdCl2 ist bekannt, dass es eine starke toxische Wirkung auf Hautzellen ausübt. Dabei liegt der EC50-Wert für normale Kulturbedingungen bei 110 µM. Für die Bedingungen einer schwachen Wechselwirkung wurden deshalb Konzentrationen zwischen 0 und 100 µM gewählt. Es zeigte sich bis zu Konzentrationen von 35 µM ein erwarteter starker Anstieg des Fluoreszenzsignals. Wurde die Konzentration weiter erhöht, zeigten die Zellen eine ungewöhnliche Morphologie und einige Zellen starben, was mit dem beobachteten Abfall der Fluoreszenzintensität einhergeht (s. Abb. 2).

Durch Kombination der fluoreszenzoptischen Sensorzelllinie mit einem zweiten, von intrazellulären Prozessen unabhängigen Detektionsverfahren könnte eine noch komplexere Beschreibung der infolge der Einwirkung einer zellschädigenden Substanz auftretenden Effekte möglich sein (s. Abb. 1). Neben der Messung der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit vom Grad der Zellstressbelastung ist mithilfe einer optischen Detektionseinheit die unerlässliche mikroskopische Kontrolle der Zellkultur möglich. Qualitative Aussagen zur Zelldichte und Zelladhäsion können getroffen werden. Das Verfahren der Impedanzspektroskopie jedoch ermöglicht die passive quantitative Beschreibung morphologischer Veränderungen der Zellen und spiegelt die Zellantwort bis zur vollständigen Permeabilisierung wider.

Der direkte Vergleich der labelfreien impedimetrischen Daten mit den Ergebnissen des Reportergenassays basierend auf HSP72 zeigte die individuellen Stärken und Limitationen der Assays auf. Während mittels Reportergenassay der Effekt besonders geringer CdCl2-Konzentrationen nachgewiesen werden konnte, erlaubte die Impedanzspektroskopie die Detektion höherer, eine akute Toxizität hervorrufender Konzentrationen des analysierten Umwelttoxins.

Leistungsfähige Sensorzelllinie

Für den Proof-of-concept wurden verschiedene Pflanzenextrakte mit bekannten zytotoxischen, reizenden sowie ggf. entzündungsfördernden und allergieauslösenden Effekten gewählt, die u. a. Anwendung in entsprechenden kosmetischen und pharmazeutischen Produkten finden. So zum Beispiel die echte Arnika, die Hundskamille, die gewöhnliche Sonnenbraut und das gewöhnliche Seifenkraut. Die Ergebnisse bestätigen die Leistungsfähigkeit der Sensorzelllinie: Für die echte Arnika, die ein starkes Kontaktallergen ist, wurde eine hohe Signalintensität gemessen, während die anderen Substanzen, wie erwartet, aufgrund des wesentlich geringeren zellschädigenden Potenzials bzgl. ihrer Messwerte deutlich darunter lagen (s. Abb. 3). Insbesondere das gewöhnliche Seifenkraut, dessen zytotoxische Wirkung auf der Zerstörung der Zellmembran und nicht auf der Bildung von ROS beruht, zeigt ein deutlich geringeres Signal. Das Sensorsystem ermöglicht es also, unterschiedliche Signal- und damit Toxizitätswege zu diskriminieren.

Die Untersuchung von gewöhnlichen Chemikalien mit dem Sensor zeigte ebenfalls dessen Leistungsfähigkeit. Unter anderem wurde Di-Nitrochlorbenzen (DNCB) und Nickelsulfat auf ihre zytotoxische Wirkung getestet. Es zeigte sich, dass DNCB in Übereinstimmung mit der bekannten kontaktallergischen Wirkung ein hohes Signalniveau lieferte (s. Abb. 4), während Nickelsulfat, das einen alternativen Zellschädigungsmechanismus beinhaltet, ein vergleichsweise geringes Signal lieferte, was ebenfalls die Möglichkeit aufzeigt, zwischen unterschiedlichen Schädigungsmechanismen zu unterscheiden.

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Implementierung des zellbasierten Assays auf das Lab-on-a-Chip-System

Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde ein Chipsystem entwickelt, welches, eingebunden in eine mikrofluidische Plattform, die Kombination beider Detektionsverfahren zur multiplen, zeitaufgelösten Detektion hautschädigender Effekte ermöglicht. Das in Abbildung 5 illustrierte dreilagige Chipsystem besitzt neun Zellkulturkammern, sodass jeweils eine Dreifachbestimmung der Untersuchungssubstanz, einer Positiv- und Negativkontrolle möglich ist. Die Zellen adhärieren auf planaren Elektroden auf der untersten Ebene, welche gleichzeitig eine Temperiereinheit enthält, um die Zellen auf Körpertemperatur von 37 °C zu kultivieren. Die mittlere Lage nimmt die Gefäße für die Zellen auf. Zu den Zell-Reservoiren führen sowohl die Zuleitungen der zu testenden Substanzen als auch der notwendigen Nährstoffe zur Zellversorgung, sowie auf der anderen Seite der Auslauf der verbrauchten Medien. Nicht zu vergessen, ist der mikrofluidische Mischer, der Zellkulturmedium und Testsubstanzen auch bei geringsten Flüssen effektiv mischt und dafür sorgt, dass alle Reservoire die gleiche Menge an Testsubstanz und Zellkulturmedium erhalten.

Eine weitere entscheidende Voraussetzung für die effektive Nutzung von zell-basierten Lab-on-a-Chip-Systemen ist die Möglichkeit der Nutzung dieser Systeme außerhalb eines Laborinkubators bei gleichzeitigem Erhalt der notwendigen sterilen Bedingungen. Mit der Entwicklung der Sensorzelllinie und der Implementierung dieser in das Chipsystem ist es gelungen, die transfizierte Sensorzelllinie außerhalb des Inkubators unter sterilen Bedingungen zu kultivieren und die vorgesehenen Untersuchungen während der gesamten Kultivierungszeit ohne Öffnen des Systems durchzuführen. Dazu wurde das Chip-System auf beiden Seiten durch Sterilfilter verschlossen und die Zellen durch ein CO2-unabhängiges Kultur-Medium bei gleichmäßiger Temperierung auf 37 °C erfolgreich am Leben erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen im Chip-System mit der gleichen Proliferationsrate wachsen, wie sie es in einer klassischen Kulturflasche tun.

Als Referenzsystem für die Stress-induzierende Wirkung von Kosmetika-Bestandteilen wurde, wie schon erwähnt, CdCl2 benutzt. Hier zeigte sich eine geringere Proliferationsrate (unter dem Mikroskop beobachtet) und ein Impedanzsignal, das ein beginnendes Absterben der Zellen detektierte. Die Nachweisgrenze lag bei 6 µM CdCl2 und damit weit unterhalb der Signifikanzschwelle für Kosmetika.

Insgesamt ist es mit der Entwicklung des Sensorzellkonstruktes und des Lab-on-a-Chip-Systems mit Inkubator-unabhängiger Kultivierung gelungen, ein zumindest für ein Pre-Screening von Einsatzstoffen in der Kosmetik-Industrie und darüber hinaus für die Testung neuer Chemikalien im Sinne der REACH-Verordnung der EU, ideal geeignetes Testsystem zu entwickeln. Es erlaubt einen Nachweis der toxischen Wirkung weit unterhalb der Absterbensschwelle der Zellen („schwache Wechselwirkung“) und ermöglicht, zwischen unterschiedlichen Zellschädigungsmechanismen zu unterscheiden.

* Prof. Dr. rer. nat. habil. K.H. Feller: Institut für Mikrosystem- und Präzisionsfertigungstechnik, Bereich Instrumentelle Analytik, Ernst-Abbe-Hochschule Jena, 07745 Jena

* *Dr. rer. nat. U. Hofmann: Analytik Jena AG, 07749 Jena

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