English China
Suchen

Feldflussfraktionierung Trennung pharmazeutischer Verbindungen mit Feldflussfraktionierung

Autor / Redakteur: Thomas Jocks* / Dr. Ilka Ottleben

Eine leistungsfähige Methode zur Trennung und Fraktionierung von Proteinen, Antikörpern und anderen pharmazeutischen Verbindungen bietet die Kombination zweier Methoden der Feldflussfraktionierung (FFF) – der Hohlfaser-Fluss-FFF (HF5) und der asymmetrischen Fluss-FFF (AF4).

Firmen zum Thema

(Bild: Wyatt)

Die Fluss-Feldflussfraktionierung (F4) ist eine Familie von universellen Trennmethoden für Moleküle und Partikel. Verbreitet ist die Asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4). Zum Funktionsprinzip: Die Trennung erfolgt in einem flachen, länglichen Kanal. Während die obere Begrenzungsplatte völlig undurchlässig ist, besteht die untere aus einer Fritte, auf der sich eine Ultrafiltrationsmembran befindet. Dadurch ist die Unterseite semipermeabel. Dies bedeutet, dass sie nur für Lösemittel (Wasser, Pufferlösung, etc.) und Moleküle bis zu einer bestimmten Ausschlussgröße durchlässig ist.

Der Trennvorgang beginnt mit der Injektion der Probe mit dem Lösemittel. Nun wird der Kanalfluss aufgeteilt, sodass er von beiden Enden des Kanals her die Probe in einem schmalen Bereich festhält, was als Fokussierung bezeichnet wird. Das Lösemittel verlässt den Kanal durch die semipermeable Bodenplatte.

Bildergalerie
Bildergalerie mit 5 Bildern

Dadurch kommt ein zweiter Flüssigkeitsstrom zustande, der Querfluss, welcher senkrecht zum Kanalfluss wirkt und die Bestandteile der Probe in Richtung der Membran bewegt. Das Zusammenspiel der Kräfte erzeugt im Fokusbereich ein Gleichgewicht, wobei jedes Molekül eine Position einnimmt, die seiner Größe (seinem spezifischen Diffusionskoeffizienten) entspricht. Große Teilchen befinden sich näher an der Membran als die kleinen Moleküle. Letztlich ergibt sich die Trennung der Probenbestandteile nach ihrer Größe, und die Fraktionen werden zur Charakterisierung in die Detektoren geleitet.

Bis vor einigen Jahren stand als Trennmethode für Makromoleküle in der Praxis meist nur die Größen-Ausschluss-Chromatographie (SEC/GPC) zur Verfügung. Hier kam es aber manchmal zu Problemen aufgrund von Wechselwirkungen mit den Analyten. Deshalb wurde für solch schwierige Separationsaufgaben vielfach die Feldflussfraktionierung (FFF) zur Methode der Wahl.

Hier soll eine Weiterentwicklung auf Basis der FFF-Technologie dargestellt werden, die Hohlfaser-Fluss-FFF (HF5). Dabei besteht der Kanal aus einer semipermeablen Membran-Hohlfaser mit porösen Wänden. Wird ein Flüssigkeitsstrom durch die Faser hindurch gepumpt, so kann ein Teil der Strömung durch die Wände austreten und bildet so die Querströmung. Durch dessen Einwirkung erfolgt die Trennung der Probenbestandteile. Diese beruht ebenso wie bei der AF4 auf den unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten der zu separierenden Komponenten und damit auf dem hydrodynamischen Radius bzw. der Molekülmasse (s. Abb. 1).

Weiterentwicklung Hohlfaser-Fluss-FFF

Der Einsatzbereich der HF5 ist ähnlich breit gefächert wie bereits für andere Feldfluss-Fraktionierungstechniken berichtet. Ein besonderer Vorteil der Hohlfaser-Technologie sind dabei die geringe Probenverdünnung und die damit verbundene hohe Nachweisempfindlichkeit. Bisherige Ergebnisse lassen erkennen, dass die HF5 das Potenzial hat, sowohl in der pharmazeutischen Industrie als auch in der Proteomics-Forschung zu einem wichtigen Werkzeug zu werden. Zudem ist das Polymer, aus dem die Hohlfasern hergestellt werden, relativ preiswert, sodass kostengünstige HF5-Kartuschen als Einmalartikel verfügbar sind.

Aufgrund der unterschiedlichen analytischen Anforderungen im pharmazeutischen Bereich ist es sinnvoll, die HF5 als zusätzliche Methode zur Verfügung zu haben, ohne auf die Flachkanal-Fluss-FFF (AF4) verzichten zu müssen. Daher war die Entwicklung eines Systems für die Feldfluss-Fraktionierung notwendig, das sowohl mit AF4- als auch mit HF5-Trennkanälen betrieben werden kann. Die gesamte Flusssteuerung für Kanal und Kartusche erfolgt dabei durch das Eclipse Dualtec-Instrument (Wyatt Technology Europe).

Das instrumentelle Set-Up (s. Abb. 2) gestaltete sich wie folgt:

  • Steuerung für AF4 und HF5: Eclipse Dualtec (Wyatt Technology Europe, Dernbach);
  • Detektion: 18-Winkel Lichtstreudetektor (MALS-Detektor) Dawn Heleos II; Differenzial-Refraktometer Optilab rEX (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, USA);
  • HPLC: Degasser Agilent 1100, isokratische Pumpe Agilent 1100, Auto Sampler Agilent 1200, Agilent 1100 (VWD) Detektor (Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

Hohe Nachweisempfindlichkeit durch weiterenentwickelte Feldflussfraktionierung

Eine wichtige Eigenschaft der Hohlfaser-Technik ist die geringere Probenverdünnung im Vergleich zur AF4. Dadurch wird eine höhere Nachweisempfindlichkeit ermöglicht (s. Abb. 3). Gezeigt ist die Höhe des UV-Signals als Funktion der Aufgabemenge des Enzymproteins Carboanhydrase (CAH) im Vergleich zwischen HF5 und zwei verschiedenen AF4-Kanälen, (SC: short channel und LC: long channel). Die Kanalhöhe ist vergleichbar (HF5 Radius 400 µm, Kanalhöhe der AF4 Kanäle 350 µm). Aufgrund des geringen Kanalvolumens von 100 µL sind die Peaks nach der HF5-Trennung um den Faktor 4 bzw. 6 höher.

In Abbildung 4 ist die HF5-Trennung eines Proteingemischs dargestellt. Es handelt sich um die Bestandteile: 1 - Carboanhydrase (1mer), 2 - BSA (1mer) + Carboanhydrase (2mer), 3 - Carboanhydrase (3mer), 4 - BSA (2mer), 5 - Apoferritin (1mer), 6 - Thyroglobulin (1mer) + Apoferritin (2mer), 7 - Apoferritin (3mer) + Thyroglobulin (2mer).

Das Fraktogramm aus der Trennung eines Proteingemischs in Abbildung 4 macht deutlich, dass die hier enthaltenen Komponenten – sowohl Monomere als auch Oligomere – problemlos nachweisbar sind. Es wird nahezu Basislinientrennung erreicht. Die Detektion von Dimeren und Oligomeren, wie sie hier exemplarisch gezeigt wird, ist beispielsweise in der Qualitätskontrolle von therapeutischen Antikörpern eine zentrale analytische Herausforderung. Der Anteil an solchen Agglomeraten darf nämlich einen bestimmten Prozentsatz nicht überschreiten. Andernfalls ist das Präparat für die therapeutische Anwendung nicht geeignet. Im folgenden Beispiel soll hierauf näher eingegangen werden.

Antikörper im Stresstest

Abbildung 5 zeigt ein Standard-Antikörperpräparat. Man erkennt die normale Verteilung der Bestandteile, nämlich Fragmente, Monomere und ein kleiner Anteil an Dimeren. Größere Aggregate der Immunglobuline sind hier nicht nachweisbar.

Anders die Situation, wenn der Antikörper Stress ausgesetzt wird, wie in Abbildung 6 zu sehen. Dieser Stress wird beispielsweise thermisch erzeugt, indem der Antikörper mehrere Tage bei -20 °C eingefroren und dann wieder aufgetaut wird. Setzt man das Präparat hohen Temperaturen aus, etwa 40 °C für mehrere Stunden, so hat dies den gleichen Effekt. Es bilden sich große Aggregate aus vielen Antikörpermolekülen. Das führt dazu, dass die Präparation für den therapeutischen Gebrauch nicht mehr verwendbar ist und verworfen werden muss. Im pharmazeutischen Produktionsprozess ist es daher unabdingbar, die Bildung solcher Verklumpungen ständig zu kontrollieren. Waren mittels Säulenchromatographie die Aggregate bislang nur unzureichend nachweisbar, so steht nun mit der HF5 für diese Überprüfungen das passende Werkzeug zur Verfügung.

Welche Vorteile bringt die Hohlfaser-Fluss-FFF

Die Resultate aus dieser Studie machen deutlich, dass die HF5 mit dem hier vorgestellten System eine ebenso gute Trennung ermöglicht wie die bereits bewährten AF4-Kanäle. Speziell die einfache Handhabung der Hohlfaser bei sehr guten Trennergebnissen auch mit „Problemkandidaten“ kann sich hier durchaus als optimaler Ansatz erweisen. Speziell im Bereich der Analyse von therapeutischen Proteinen stellt die Feldfluss-Fraktionierung ein wertvolles Werkzeug dar, mit dem man den teils sehr unterschiedlichen Herausforderungen begegnen kann. Einerseits steht oft nur eine sehr limitierte Menge an wertvoller Probe zur Verfügung, sodass eine hohe Empfindlichkeit der Analyse unabdingbar ist. Andererseits – etwa in der QC von Antikörpern – hat man es bisweilen mit deutlich höheren Stoffkonzentrationen zu tun. Auch unter diesen Umständen muss die Messung absolut exakt und zuverlässig sein, damit man verlässliche Daten über Molmassen, Molekülgrößen, Löslichkeit und Aggregation gewinnen kann. Damit sind die methodischen und instrumentellen Anforderungen klar: Erforderlich ist eine Analytik, die über einen weiten Konzentrationsbereich hinweg robust und reproduzierbar arbeitet. Die Kombination aus AF4 und HF5 erfüllt diese Voraussetzungen und dürfte sich zukünftig für viele analytische Aufgabenstellungen, insbesondere zur Charakterisierung therapeutischer Peptide oder Proteine, als die Methode der Wahl etablieren.

* Dr. T. Jocks: Wyatt Technology Europe GmbH, 56307 Dernbach

(ID:42437307)