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GC-Analytik Verifizierungstechniken in der GC-Analytik von Mykotoxinen

Autor / Redakteur: Wolfgang Brodacz* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Der zweifelsfreien Identifizierung von Schadstoffen muss bei der Kontrolle von Lebens- und Futtermitteln höchste Priorität eingeräumt werden. Bei rechtlich relevanten Ergebnissen ist auch die quantitative Absicherung von zentraler Bedeutung. Am Beispiel der GC-Analytik von Trichothecen Mykotoxinen sollen die möglichen Strategien im chronologischen Ablauf der Analyse erläutert werden.

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Abb. 1 GC-analytische Verifizierungstechniken für Trichothecene (empfohlene Varianten in Farbe).
Abb. 1 GC-analytische Verifizierungstechniken für Trichothecene (empfohlene Varianten in Farbe).
( Archiv: Vogel Business Media )

Am Anfang steht auch bei der Mykotoxin-Analytik von Lebensmitteln die Probenvorbereitung. Ausgehend von einem Acetonitril/Wasser-Rohextrakt erfolgt meist ein unspezifisches SPE-cleanup mit „MycoSep 227 Trich+“ (Romerlabs) zur Entfernung des Großteils der störenden Matrixbestandteile (s. Abb. 1). Dabei eluieren alle wichtigen Trichothecene (vier A-Typen und fünf B-Typen), sodass sich diese Reinigung für Multitoxin-Analysen eignet [1].

Durch Nachschalten einer Immunoaffinitätssäule (IAC) kann schon zu diesem Zeitpunkt eine Reduktion des „chemischen Rauschens“, insbesondere bei nichtspektroskopischer Detektion erreicht werden. IACs besitzen monoklonale Antikörper für meist nur einen Zielanalyten, den sie beim Reinigungsprozess sehr selektiv binden. Nachdem die Matrixbestandteile aus der Säule gespült sind, werden die Antikörper gezielt denaturiert und das Mykotoxin aufgereinigt in einem kleinen Elutionsvolumen freigesetzt. Nachteile dieser spezifischen Zusatzreinigung sind der deutlich größere Arbeitsaufwand, die hohen Kosten der Spezialsäulen und die vergleichsweise drastische Einschränkung des Analytenspektrums auf z.B. nur Deoxynivalenol (DON; Leitsubstanz der Typ-B Trichothecene).

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Für die Gaschromatographie müssen die relativ polaren Zielanalyten einer Derivatisierung unterzogen werden. Dabei werden sie üblicherweise durch Silylierung oder Perfluoracylierung (mit HFBI) umgesetzt [2]. Zur qualitativen und quantitativen Absicherung können nun beide Derivatisierungstechniken parallel angewandt werden. Durch die Differenzierung steigt zwar der Informationsgehalt an, der Aufwand für die arbeitsintensive Derivatisierung und bei der GC muss dafür aber verdoppelt werden.

Wichtig: Selektive Detektion in der GC

Spezifische und empfindliche Detektion ist neben einer guten chromatographischen Trennung die Voraussetzung für quantitative Bestimmungen. Im Falle der silylierten B-Trichothecene ist der kostengünstige Elektron-Capture-Detektor (ECD) aufgrund der Carbonyl-Gruppe (C8) sowohl spezifisch als auch sehr empfindlich. Mithilfe der computergestützten Trennungsoptimierung und der GC-Simulation können effiziente Separationen erzielt werden. Von besonderer Bedeutung ist dabei die parallele Chromatographie auf zwei möglichst unterschiedlichen GC-Phasentypen [3]. Dies wird auch in einer EU-Richtlinie gefordert, wenn nichtspektroskopische Detektoren verwendet werden [4]. Nach den langjährigen rückstandsanalytischen Erfahrungen des Autors sind Polaritätsunterschiede von nur fünf Prozent Phenylanteil (100 Prozent gegen 95 Prozent Methyl-Polysiloxan) dafür meist nicht ausreichend [5].

Ein Beispiel aus der Kontrollpraxis von Futtermitteln zeigt anhand einer Schweinemastfutterprobe die Notwendigkeit von zwei Kapillaren mit großer Polaritätsdifferenz (s. Abb. 2). Während auf der polaren Phase Fusarenon X scheinbar exakt zur erwarteten Retentionszeit auftaucht, wird auf der unpolaren Säule (unten) zur FusX-Zeit (roter Pfeil) kein Peak registriert. Genau umgekehrt verhält es sich mit dem DON-Metaboliten 3-Acetyl-Don (orange Markierung). Würde man, wie in vielen Publikationen vorgeschlagen, nur mit der unpolaren Phase analysieren, käme ein Fehlgehalt von über 700 Mikrogramm pro Kilogramm 3AcDON, bei alleiniger Verwendung der polaren Variante ein Fehlgehalt von 11 000 Mikrogramm pro Kilogramm Fusarenon X zustande.

In der Praxis gilt eine Substanz erst dann als nachgewiesen, wenn folgende Forderungen erfüllt sind:

  • Der Retentionszeit-Referenzpeak (Mirex) liegt im erwarteten Bereich und aktualisiert die minimierten Erkennungsfenster für die Zielanalyten („RT-Feinanpassung“ bei jeder Injektion).
  • Der Zielanalyt erscheint auf beiden Säulen im jeweiligen Zentrum seines Identifizierungsfensters.
  • Es sollten vergleichbare Quantifizierungsergebnisse vorliegen, ansonsten wird nur der geringere Wert akzeptiert (Interferenz).

Der doppelte Aufwand der Zwei-Säulentechnik wird aber nicht nur durch die gesteigerte Identifizierung gerechtfertigt, sondern auch durch den zusätzlichen Vorteil einer verbesserten Quantifizierung. Zwei unabhängige Kalibrierungen und Auswertungen lassen gerätespezifische Probleme schon im Ansatz erkennen.

Selektivität durch GC/MSD

Der wichtigste Schlüssel für effiziente Verifizierungen lautet „Selektivität bei der Messung“, und die effektivste Technik dafür ist die GC/MS. Selbst strukturverwandte Trichothecene zeigen deutliche Unterschiede in ihren EI-Spektren. Am Beispiel der Absicherung einer ungewöhnlich hohen Kontamination von Mais mit Fusarenon X zeigt sich der Selektivitätsgewinn mit der GC/MSD-Technik. Bei grenzwertrelevanten Belastungen darf sogar davon ausgegangen werden, dass mit der aktuellen MSD-Generation ausreichend Nachweisempfindlichkeit zur Verfügung steht, um auch aussagekräftige Vollspektren aufnehmen zu können. Bei Übereinstimmung der Retentionszeiten (chromatographische Dimension) bestätigt der (automatisierbare) Vergleich mit kommerziellen MS-Bibliotheken oder selbst aufgenommenen Referenzspektren, die Identität des Zielanalyten zusätzlich in der spektroskopischen Dimension.

Für die Absicherung von Spurenkonzentrationen mittels GC/MSD bedient man sich der deutlich empfindlicheren „Selected Ion Monitoring“-Methode (SIM). Anstelle großer Spektrenbereiche werden pro Zielanalyten zeitgesteuert drei charakteristische Ionen aufgezeichnet [4]. Die Quantifizierung basiert meist auf dem aussagekräftigsten Ion (im Idealfall dem Molekularion), während die anderen Ionen als „Qualifier“ die Identität bestätigen [6]. Deren Auswahl orientiert sich (je nach Signalstärke) am oberen Spektrenbereich. So sollten vom Molekularion ausgehend jene Fragmente gewählt werden, die sich durch charakteristische Abspaltungen direkt davon ableiten lassen (s. Abb. 3). Mit der SIM-GC/MS stehen durch die Selektivitätssteigerung auch bei sehr matrixbelasteten Messlösungen gut auswertbare und störungsfreie Chromatogramme zur Verfügung (s. Abb. 4).

Die Identität einer Verbindung gilt dabei als gesichert, wenn:

  • alle charakteristischen SIM-Ionen deckungsgleich im Zentrum des erwarteten Retentionsfensters vorhanden sind und
  • die Flächenverhältnisse der SIM-Peaks denen des Kalibrierstandards entsprechen (s. Abb. 5).

Fazit

Die Selektivität einer Analyse durch zusätzliche Reinigungsschritte und/oder parallele Derivatisierungsverfahren zu verbessern, ist grundsätzlich möglich, meist aber wenig effektiv und immer mit wesentlich höherem Aufwand verbunden. Am effizientesten ist es, den nicht automatisierbaren Aufwand vor der Chromatographie auf das Nötigste zu reduzieren und statt dessen in die Selektivität der GC-Bestimmung zu investieren. Die Gaschromatographie bietet durch die hohe ECD-Empfindlichkeit in Kombination mit der sehr guten Trennleistung für die Routineanalytik einer Reihe von Trichothecenen viele Vorteile. Die Verifizierung auf zwei Phasen möglichst unterschiedlicher Polarität sollte dabei ebenso selbstverständlich sein wie sorgfältig optimierte Trennbedingungen. Die aktuelle MSD-Generation zeichnet sich durch sehr gute Empfindlichkeit und Inertheit aus, sodass die GC/MS auch in der Multitoxin-Analytik ihre Vorzüge (Sensitivität und hohe Selektivität mit kostengünstiger ausgereifter Technik) ausspielen kann. Neben hochsensitiven Bestimmungen im „Selected Ion Monitoring“ können meistens auch Vollspektren aufgezeichnet werden. Die Agilent GC/MS- Systeme der neuesten Generation erlauben simultane Scan/SIM-Messungen wodurch Identifikation und empfindliche Quantifizierung in einem Analysengang ermöglicht werden. Für eine Erweiterung der Multimethode auf verschiedene, polare Mykotoxinklassen (z.B. Trichothecene, Zearalenon, Fumonisine, Ochratoxin A oder Aflatoxine) ist dann allerdings die kostenintensivere LC/MS/MS notwendig. Neu entwickelte Triple-Quadrupole-Systeme vereinen im MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring) hohe Selektivität mit guter Sensitivität und ermöglichen damit eine weitere Reduktion der Probenvorbereitung.

Literatur

[1] W. Brodacz, „Langzeiterfahrungen in der GC-Routineanalytik von Mykotoxinen“, LaborPraxis LP 7/8, S 32 – 34; August 2005

[2] Krska R., Baumgartner S., Josephs R.; „The state-of-the-art in the analysis of type-A and -B trichothecene mycotoxins in cereals“; Fresenius J. Anal Chem; 371; 285-299; 2001

[3] W. Brodacz, „Auswahl von GC-Phasen und Optimierung von Trichothecen-Trennungen mittels Computersimulation“, Mycotoxin Research Vo. 21, No. 1, S. 11-14, 2005

[4] Entscheidung der Kommission vom 12. August 2002 zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen; (2002/657/EG)

[5] W. Brodacz, „Vergleich und Kombination von GC-Phasen“, LaborPraxis LP 4, S 48 – 53; April 2004

[6] W. Brodacz, „Verifizierungsstrategien in der GC-Rückstandsanalytik“, LaborPraxis LP3, S 36 - 39; März 2003

*W. Brodacz, Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit ,Kompetenzzentrum „Cluster Chemie Linz“, 4020 Linz/Österreich

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