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Protein-Tag Vielseitiger Protein-Tag für Säugetierzellen

| Redakteur: Dr. Ilka Ottleben

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Mit dem HaloTag von Promega lassen sich mit einem einzigen Vektorkonstrukt Proteine aus Säugetierzellen aufreinigen, in Pull- Downs einsetzen und lokalisieren. (Bild: Promega)
Mit dem HaloTag von Promega lassen sich mit einem einzigen Vektorkonstrukt Proteine aus Säugetierzellen aufreinigen, in Pull- Downs einsetzen und lokalisieren. (Bild: Promega)

Mit drei neuen Systemen von Promega – dem HaloTag Mammalian Protein Purification System, dem HaloTag Mammalian Pull-Down System und dem HaloTag Mammalian Protein Detection and Purification System – lassen sich mit einem einzigen Vektorkonstrukt Proteine aus Säugetierzellen aufreinigen, in Pull-Downs einsetzen und lokalisieren. Mit den HaloTag-Fusionsproteinen können Co-Lokalisationen, Real-Time-Imaging, Durchflusszytometrie und Western Blots durchgeführt werden. Das System beruht auf der spezifischen kovalenten Bindung des Tags an Resin und Liganden. Für zahlreiche humane oder Maus-Open-Reading-Frames (ORF) können validierte Klone über das Kazusa DNA Research Institute (www.kazusa.or.jp) bestellt werden.

Mammalian Protein Purification System

Wie Ohana [1] zeigen konnte, ermöglicht das HaloTag Mammalian Protein Purification System höhere Ausbeuten als FLAG- und His6-Tags, heißt es in einer Pressemeldung von Promega. Bei Letzteren besteht ein Bindungs-Gleichgewicht, wodurch Fusionsproteine ungebunden bleiben und so nicht mit aufgereinigt werden. Im Gegensatz dazu ist die Ausbeute mit dem HaloTag durch die kovalente Bindung selbst bei geringen Expressionsleveln sehr hoch (ab 63 Prozent). Im Tag integriert ist die Erkennungssequenz für die Protease TEV. Die Protease mit dem Tag setzt das Protein frei, bleibt aber selbst am Resin gebunden.

Mammalian Pull-Down System

Das HaloTag Mammalian Pull-Down System ermöglicht den Pull-Down intrazellulärer Proteinkomplexe binärer und höherer Ordnung. Transiente oder schwach interagierende Partner werden zuverlässig an den Liganden gebunden. So konnten von u.a. Méndez [2] etwa Interaktionspartner sowie fast alle Bestandteile des supramolekularen Nuclear Pore Complex Nup 107-160 mit den getaggten Nup37 bzw. Nup 43 aufgereinigt werden.

Mammalian Protein Detection and Purification System

Zusammen mit Markern, die unterschiedlich gut die Zellmembran durchqueren, lassen sich mit dem HaloTag Mammalian Protein Detection and Purification System Populationen des Fusionsproteins unterscheiden und Trafficking-Studien durchführen. Da der Tag nicht von alleine fluoresziert, sondern über einen Liganden markiert wird, ist er im Vergleich zu GFP-Tags flexibler mit anderen Fluorophoren zu kombinieren. Ebenfalls möglich: die Immunozytochemie nach dem Fixieren und die Analyse von Fluorophormarkiertem Fusionsprotein auf SDS-Gelen.

Quellen:

[1] Friedman Ohana, R., Hurst, R., Vidugiriene, J., Slater, M.R., Wood, K.V., Urh, M. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells. 2011. Protein Expression and Purification, Vol. 76(2): 154-164.

[2] Méndez, J., Murphy, N., Benink, H., Daniels, D. and Urh, M. Efficient Isolation, Identification and Labeling of Intracellular Mammalian Protein Complexes. [Internet] 2010. [cited: 2011, April, 27].

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