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Zweiphotonenmikroskopie Visualisierung tiefer Gewebeschichten mit OPO-Infrarotlaser

Autor / Redakteur: Andrea Pfeifer* und Bernd Sägmüller* / Doris Popp

Das IGBMC in Straßburg widmet sich der Erforschung eukaryotischer Genome, der Kontrolle der Genexpression sowie der Analyse von Genfunktionen. Die Forscher setzen dabei auf eine neue Technologie zur Visualisierung tiefer Gewebeschnitte – die Zweiphotonenmikroskopie mit OPO-Infrarotlaser.

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Abb.1: Milz der Maus: Blutgefäße markiert mit 70kD-Texas Red angeregt mit OPO bei 1150 nm (rot). Simultane Anregung bei 800 nm zeigt das SHG-Signal (second harmonic generation) von Typ I Kollagen (violett) und die Autofluoreszenz vereinzelter Zellen (grün).
Abb.1: Milz der Maus: Blutgefäße markiert mit 70kD-Texas Red angeregt mit OPO bei 1150 nm (rot). Simultane Anregung bei 800 nm zeigt das SHG-Signal (second harmonic generation) von Typ I Kollagen (violett) und die Autofluoreszenz vereinzelter Zellen (grün).
(Bild: Leica Microsystems)

Die Abbildung dicker Gewebeschnitte sowie ganzer Organismen spielt in der biomedizinischen Forschung eine immer größere Rolle. Räumliche Informationen aus tiefen Gewebebereichen zu gewinnen, ist für ein Gesamtverständnis biologischer Prozesse unabdingbar. Jedoch nimmt die Bildqualität mit zunehmender Probentiefe ab, da biologische Proben Licht sehr stark streuen. Mit Standard-Weitfeld- oder Konfokalfluoreszenzmikroskopen und Anregungsquellen im sichtbaren Bereich kann man bis etwa einhundert Mikrometer in die Probe eindringen. Leider ist es mittels sichtbaren Lichts unmöglich, eine Eindringtiefe von mehreren Hunderten von Mikrometern zu erreichen. Da die Lichtstreuung von der Wellenlänge abhängt, lässt sich eine bessere Eindringtiefe durch eine längerwellige Anregung erzielen. Um tiefe Gewebeschichten in erheblich verbesserter Qualität abzubilden, werden zur Anregung gepulste Infrarotlaser und optisch-parametrische Oszillatoren (OPO) unter Ausnutzung von Zweiphotonenprozessen eingesetzt.

Wie werden längere Anregungswellenlängen angewendet?

Zunächst sind Laserlichtquellen im roten und infraroten Bereich erforderlich. Normalerweise beginnen diese Ti:Sa (Titan:Saphir) Lichtquellen bei roten Wellenlängen von etwa 680 nm und reichen in den Infrarotbereich bis knapp über 1000 nm. Zweitens werden zwei Photonen benötigt, die den Fluoreszenzfarbstoff zu ungefähr derselben Zeit erreichen. Zwei Photonen von z.B. 1000 nm gleichen dann zusammengenommen der Energie einer Anregungswellenlänge von etwa 500 nm.

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Dieses Verfahren heißt Multiphotonen- bzw. Zweiphotonenmikroskopie. Wenn die maximale Wellenlänge des IR-Lasers bei 1080 nm liegt, beträgt die längste erreichbare Anregung in diesem Zweiphotonenprozess 540 nm. Viele der in der biologischen Forschung eingesetzten Marker und Farbstoffe brauchen aber eine längere Anregungswellenlänge und kommen nur dann für das Zweiphotonenverfahren in Betracht, wenn eine Anregungswellenlänge von mehr als 1080 nm verwendet wird. Mit einem optisch-parametrischen Oszillator (OPO) sind nun Anregungswellenlängen von bis zu 1300 nm im Zweiphotonenverfahren möglich. Dies erlaubt den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen mit einem Anregungsmaximum bis etwa 650 nm, was für die Zweiphotonenmikroskopie einen großen Vorteil darstellt. Je mehr Farbstoffe mit dem Zweiphotonenverfahren anregbar sind, desto mehr Informationen können aus Proben mit großen Abbildungstiefen gewonnen werden.

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