UHPLC-Methodenentwicklung Vollautomatisierte Methodenentwicklung in der UHPLC

In der HPLC hat die Methodenentwicklung bisher viel Zeit erfordert. Eine neue automatisierte Lösung kann nun viele verschiedene Kombinationen schnell aufklären und überprüfen. So erlaubt sie es, die optimale Methode sogar für UHPLC-Applikationen in sehr kurzer Zeit zu entwickeln.

Anbieter zum Thema

Shimadzu Deutschland GmbH

TOSOH Bioscience GmbH

YMC Europe GmbH

Das Auswählen der Säule und die Wahl und Zusammensetzung der Eluenten sind häufig die wichtigsten und auch zeitaufwändigsten Schritte bei der Methodenentwicklung einer Applikation für die HPLC. Hierbei müssen zahlreiche Aspekte sorgfältig beachtet werden. Bei der Wahl und Zusammensetzung der Eluenten spielen viele Faktoren eine wichtige Rolle (pH-Wert, Puffer, organisches Lösungsmittel, etc.). Einen genauso großen Einfluss auf die Chromatographie hat auch die Auswahl der Säule (ODS, Phenyl, PFP, etc.). Diese Selektion erfordert Zeit. Aus diesem Grund ist eine automatisierte Lösung, die diesen Prozess unterstützt und viele verschiedene Kombinationen schnell aufklären und überprüfen kann, eine effiziente Hilfe, um die HPLC-Methodenentwicklung zu beschleunigen. Die Entwicklung von Methoden gerade für konventionelle HPLC erfordert die meiste Zeit. Die neue Technik der UHPLC, die stetig mehr in Laboren verwendet wird und sehr effizient die Analysenzeiten verkürzt, ist deshalb die logische Wahl, eine Systemlösung für die Methodenentwicklung zu erarbeiten.

Automatisiertes Überprüfen von Methoden-Kombinationen

Der schematische Aufbau des Geräts ist im oberen Teil von Abbildung 2 ersichtlich. Er basiert auf der bis 1300 bar druckstabilen UHPLC Nexera von Shimadzu. Hierbei werden zwei Niederdruckeinheiten als Lösungsmittelauswahlventile für die Pumpen verwendet, um damit durch eine Hochleistungsmischkammer in den Probengeber zu gelangen. Somit kann eine maximale Kombination der verschiedenen Eluenten von bis zu 16 erfolgen. Darauf folgen ein 7-Port- und 6-Positionen-Hochdruck-Schaltventil, was die Nutzung von bis zu sechs verschiedenen Säulen ermöglicht.

Die Detektion des Nexera-Method-Scouting-Systems kann mit einem Photodiodenarray-Detektor (SPD-M20A) erfolgen, wobei es auch möglich ist, ein Shimadzu-Massenspektrometer zu verwenden, wie etwa das Single-Quadrupol-Massenspektrometer LCMS-2020. Basierend auf diesem System mit bis zu 16 Eluenten und sechs Säulen ist ein Maximum von 96 verschiedenen Methodenkombinationen möglich.

In Abbildung 2 ist die Software-Oberfläche zur Nexera-Method-Scouting-Lösung gezeigt. Diese wird zusätzlich zum normalen HPLC-Software-Paket Labsolution (Shimadzu) benötigt und erstellt vollautomatisch die Probentabelle (Batch) mit den verschiedenen Methodenkombinationen – unter Berücksichtigung der Lösungsmittelwechsel sowie der verschiedenen Säulen und unterschiedlichen Gradienten. Somit können die Nutzer in kurzer Zeit die Bedingungen für ihren Batch-File und somit die Methodenentwicklung festlegen.

Einfache, softwaregestützte Benutzeroberfläche für die UHPLC-Methodenentwicklung

Es kann hierbei im oberen Teil der Abbildung 2 mit einem Klick eine Auswahl für die gewünschten und zuvor angelegten Lösungsmittel und Säulenkombinationen erfolgen. Danach ist sofort die pro Flasche benötigte Lösungsmittelmenge sichtbar, das aufsummierte Injektionsvolumen der Probe und die ungefähre Gesamtlaufzeit der Analysen.

In der Mitte sieht man die Auswahl der in Labsolution erstellten Methode, worin die Flussrate, Säulentemperatur und zum Beispiel die Detektionswellenlänge festgelegt werden. Die Datennamen werden vollautomatisch mit einer logischen Bezeichnung (Eluenten, Säulenauswahl und Start- und Endkonzentration) erstellt, wobei es möglich ist, einen Präfix zu vergeben.

Die Bedingungen für den Gradienten, wie Start- und Endkonzentration und Dauer der einzelnen Schritte, kann im unteren Teil festgelegt werden. Hierbei gibt es unter dem Button „Advanced Settings“ noch weitere Möglichkeiten zur stufenweisen Modifikation der Start- und/oder der Endkonzentrationen, die in der Abbildung 3 zu sehen ist.

Der letzte Schritt – mit einem Mausklick in wenigen Sekunden durchführbar – ist die Erstellung des Batches (Probentabelle). Hierbei lassen sich, wie auch normalerweise in der Labsolution-Software üblich, immer noch nachträglich Dinge wie Datennamen etc. verändern, oder es können Analysen hinzugefügt oder entfernt werden.

Automatische Ergänzung der Probentabelle

Eine weitere Erleichterung bei der vollautomatischen Erstellung der Probentabelle ist die mögliche Ergänzung durch „System Check“, „Auto purge“ oder die Art und Dauer der gewünschten Säulenequilibrierung für die verschiedenen Eluenten. Diese ist für die Analysen besonders wichtig, da nur mit einer Säule, die vollständig mit dem entsprechenden Eluenten equilibriert ist, auch reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden können. Die Auswertung der aufgenommen Daten kann durch individuelle Analysenreporte erfolgen oder durch das Vergleichen der einzelnen Daten im Data-Browser der Labsolution-Software. Hierbei können sowohl die Chromatogramme, Peak-Tabellen oder auch Spektren angeschaut und verglichen werden. Für eine große Zahl von aufgenommenen Chromatogrammen, zur Quantifizierung und zum einfachen Evaluieren der besten Chromatographie-Bedingungen, eignet sich vorzugsweise der „Class-Agent Report“. Hierbei kann mit Microsoft Excel, eine einfache Darstellung von verschiedenen Parametern (Peak-Trennung/Auflösung – Resolution, Peak-Anzahl etc.) gemacht werden. Eine exemplarische graphische Darstellung ist in Abbildung 4 aufgeführt.

* *Dr. B. Richrath: Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

(ID:37137560)