Resistenz-Profiling per Microarray „Vor-Ort“-Antibiotikaresistenz-Detektion im Chipkartenformat

Die einstigen Wunderwaffen werden zunehmend stumpf – Antibiotikaresistenzen sind ein globales Problem. Ihre schnelle Detektion kann mitunter viel Leid ersparen. Für die notwendige Beschleunigung der Analyse bei gleichzeitiger Miniaturisierung bietet sich eine Mikrofluidik-basierte Lösung geradezu an.

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KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH

C3 Prozess- und Analysentechnik GmbH

Socorex Isba SA

BiFlow Systems GmbH

Fraunhofer-Institut für Elektronische Nanosysteme ENAS

In den letzten Jahrzehnten konnte ein wachsender Trend zur Miniaturisierung laboranalytischer Verfahren in der human- und veterinärmedizinischen Diagnostik beobachtet werden. Ziel war hierbei meist, die Analyseergebnisse schneller und v.a. „vor Ort“ verfügbar zu machen. Während sich einfache biochemische Nachweise häufig in Form von Kapillar-getriebenen Teststreifen (lateral flow strips) abbilden lassen, benötigen komplexere Analysen, speziell die Analyse von DNA-basierten Markern, eine Vielzahl von Prozessschritten.

Neben dem Flüssigkeitshandling (Pipettieren, Mischen, Trennen etc.) sind häufig auch thermische Schritte für Lyse, Amplifikation oder Hybridisierung notwendig. Wenn solch komplexe Analyseverfahren „vor Ort“ ermöglicht werden sollen, ist Mikrofluidik, also die Manipulation kleinster Flüssigkeitsmengen, eine der Schlüsseltechnologien. Im miniaturisierten Gesamtsystem müssen jedoch alle notwendigen Prozessschritte reproduzierbar und robust durchgeführt werden können.

Eine derartige Technologieplattform wurde in den vergangenen Jahren entwickelt. Sie erlaubt es, eine Vielzahl kompakt integrierbarer Pumpen, Heizer und Ventile in kleinen Einweg-Kartuschen der Größe einer Chipkarte zu integrieren. Im Mittelpunkt der Technologieplattform stehen dabei elektrochemische Pumpen, welche ohne mechanisch-bewegte Komponenten oder externe Druckluftversorgung Flüssigkeiten bewegen können. Vielmehr können sie von einem kompakten Gerät elektrisch angesteuert und angetrieben werden und eignen sich damit sogar für den Betrieb über ein Mobiltelefon.

Abbildung 1 zeigt schematisch den Aufbau einer solchen Kartusche. Wie hier zu sehen ist, können auf Basis der Technologie auch Heizelemente integriert werden, wie sie beispielsweise für molekularbiologische Nachweise erforderlich sind (z.B. DNA-Amplifikation und -Hy­bridisierung). Diese Kartuschen wurden sowohl für Protein-basierte Analytik (z.B. ELISA), als auch DNA-basierte Diagnostik eingesetzt. Anwendungsbereiche umfassen die Human- und Veterinärdiagnostik, aber auch die Lebensmittel- und Umweltanalytik sowie Landwirtschaft. Im Folgenden wird ein Anwendungsbeispiel aus der Veterinärdiagnostik auf Basis eines DNA-Nachweises beschrieben.

DNA-basierte Erreger- und Resistenzdetektion

Die Entwicklung von Antibiotikaresistenzen ist zunächst ein natürlicher, auf genetische Veränderungen der Erreger zurückzuführender Anpassungsprozess. Aufgrund der übermäßigen oder falschen Anwendung von Antibiotika kommt es jedoch zu einer starken Beschleunigung dieses Prozesses. Als Folge werden Antibiotika zunehmend ineffektiv, was eine große Gefahr für die Behandlung von Krankheiten für zukünftige Generationen birgt.

Für eine zielgerichtete Antibiose, d.h. Behandlung mit Antibiotika, ist daher neben der Bestimmung der pathogenen Spezies auch deren Antibiotikaresistenz-Profil von großer Bedeutung. Nur so können ausschließlich wirksame Antibiotika verwendet werden und somit der Einsatz von Reserve- oder Breitbandantibiotika auf wenige Fälle beschränkt bleiben. Heutige Antibiogramme basieren zumeist auf dem Anlegen einer Kultur auf einem Nährmedium unter Zusatz der relevanten Antibiotika. Ein solches Verfahren erfordert Prinzip-bedingt zwischen 24 und 48 Stunden für das Wachstum der Pathogene – eine Zeitspanne, die für akute Fälle zu lang ist. Hier wäre eine schnellere Bestimmung der Resistenzlage (<1 h) – möglichst direkt vor Ort – wünschenswert.

Eine Methode zur Verkürzung der Zeit, die erforderlich ist, um eine Aussage über die Antibiotikaresistenz der Erreger zu treffen, ist die Analyse der DNA der Erreger auf bekannte, mit Resistenzen assoziierte genetische Veränderungen. Für einige Resistenzmechanismen genügt dabei die Identifikation eines spezifischen Gens, während für andere auch die Analyse von Punktmutationen, also der Austausch einzelner Basenpaare der DNA, erforderlich ist.

Aufgrund der vielfältigen Resistenzmechanismen und entsprechenden genetischen Veränderungen müssen daher eine Vielzahl solcher molekularen Veränderungen gleichzeitig detektiert werden. Eine Methode hierfür ist die Nutzung so genannter Microarrays, die es erlauben, eine Vielzahl verschiedener, zu den gesuchten DNA-Sequenzen komplementärer, Basenstränge („Sonden“) auf einer kleinen Fläche von wenigen Quadratmillimetern anzuordnen. Wird ein solches Microarray von einer Probenflüssigkeit mit der Erreger-DNA überströmt, so binden spezifisch nur die „passenden“ komplementären Fragmente, was anschließend – zumeist optisch – detektiert werden kann.

Ein solches Microarray kann auf einer dünnen Kunststofffolie realisiert werden und lässt sich in die zuvor beschriebenen Kartuschen als „Sensor“ integrieren. Die Kartusche übernimmt dabei sämtliche Aufgaben des Flüssigkeitstransportes zum Sensor sowie die – für eine spezifische Bindung der DNA (Hybridisierung) erforderliche – Temperierung des Sensorbereiches. Die Kartusche selbst besitzt lediglich elektrische Kontakte zu einem Ansteuergerät, welches die Pump- und Heizsequenz steuert und nach erfolgter Hybridisierung den Sensorbereich (Microarray) optisch ausliest.

Anwendungsbeispiel: Mastitis bei Milchkühen

Mastitis, also eine Euterentzündung, gehört zu den drei häufigsten Abgangsursachen bei Milchkühen. Solche Euterentzündungen werden meist durch bakterielle Erreger verursacht. Eine Mastitis ist mit Schmerzen für das Tier verbunden und kann im schlimmsten Fall zum Tod führen. Wirtschaftlich gesehen reduziert eine solche Euterentzündung die Milchleistung.

Sowohl während der akuten Infektion als auch während der Behandlung darf die Milch nicht verwertet werden. Nicht angemessen behandelt kann sich eine subklinische chronische Entzündung entwickeln, welche langfristig die Milchleistung reduziert. Daher ist bei Mastitis eine gezielte und frühzeitige – meist antibiotische - Behandlung notwendig, da sich das Krankheitsbild auch oft binnen Stunden verschlechtert.

Zur schnellen Erreger- und Antibiotikaresistenzdetektion bei Mastitiden von Milchkühen wurden daher im Rahmen eines interdisziplinären Forschungsprojektes eine mikrofluidische Kartusche sowie ein anwendungsspezifisches Mi­croarray entwickelt. Die Kartusche enthält hierbei neun Flüssigkeitsreservoire mit integrierten Pumpen sowie verschiedene Heizbereiche, welche für die DNA-Amplifikation sowie die Hybridisierung der DNA auf dem Microarray benötigt werden.

Im Folgenden soll exemplarisch der Ablauf einer Kartuschen-inte­grierten Hybridisierung auf einem Microarray näher beschrieben werden. Zunächst werden die Reservoire der Kartusche wie folgt befüllt:

• Reservoir 5 (50 µl): Pre-Hybridisierungspuffer

• Reservoir 6a (65 µl): Hybridisierungspuffer

• Reservoir 6b (65 µl): Amplifizierte DNA

• Reservoire 7-9 (je 100 µl): verschiedene Waschpuffer

Die Kartusche wird anschließend in das Ansteuer- und Auslesegerät (s. Abb. 4) eingesteckt und der Versuchsablauf gestartet. Der komplette Prozess läuft dann vollständig automatisch bis zur Quantifizierung der einzelnen Spots des Mi­croarrays. Das Hybridisierungsprotokoll ist in Tabelle 1 dargestellt. Abbildung 3 zeigt ein exemplarisches Fluoreszenz-Bild (Falschfarbendarstellung) des Microarrays für die Detektion der DNA eines Methicillin-resistenten staphylococcus aureus (MRSA).

Die Arbeiten zur Mastitis bei Milchkühen wurden mit Mitteln des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) und des Freistaates Sachsen gefördert. Besonderer Dank gilt der Inotec FEG mbH, Leipzig für die Entwicklung des Auswerte- und Ansteuergerätes, der Aform AG und AFEX GmbH für die Entwicklung des Spritzgusswerkzeuges und -prozesses sowie der Klinik für Klauentiere der Universität Leipzig.

* Dr.-Ing. J. Nestler: Biflow Systems GmbH, 09126 Chemnitz

* *A. Morschhauser: Fraunhofer ENAS, 09126 Chemnitz

* **Dr. H. Peter: Fraunhofer IZI-BB, 14476 Potsdam-Golm

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