Schokolade Was ist in der Schokolade drin?

90 Tafeln Schokolade essen die Bundesbürger durchschnittlich pro Jahr. Doch was ist drin in der Deutschen liebsten Süßigkeit? Mit einer quantitativen analytischen Methode lassen sich die Additive und die Qualität des enthaltenen Kakaos bestimmen.

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Schokolade ist eine der populärsten und beliebtesten Süßigkeiten für Jung und Alt. Besonders Kinder lieben Schokoladenriegel, Kuchen, Eis, Kakao und unzählige weitere Produkte, die aus Kakaobohnen gewonnen werden. Neben den bekannten negativen Effekten von hohem Fett- und Zuckergehalt dieser Produkte, gibt es allerdings auch gesundheitsfördernde Aspekte. Diese positiven Effekte können blutdrucksenkend oder antioxidativ sein; auch die Reduktion von Herz-Kreislauf-Problemen und Steigern der Wahrnehmungsfähigkeit sind vorwiegend den in dunklen Schokoladen (≥40 % Kakao) enthaltenden Flavonoiden zuzuschreiben.

Allerdings erhöht sich mit einem hohen Kakaobohnenanteil nicht nur die Rate enthaltener Flavonoide, sondern auch die Menge an – unter Umständen weniger wünschenswerten – Alkaloiden, wie die Aufputschmittel Koffein und Theobromin. Zusätzlich zu den vielen Inhaltsstoffen des natürlichen Kakaoprodukts, enthält Schokolade eine Vielzahl von Zusätzen, die den Geschmack, die Haltbarkeit oder das Aussehen beeinflussen.

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Um diese Additive zu bestimmen und um eine Aussage über die Qualität des enthaltenen Kakaos zu machen, wird eine analytische Methode benötigt, die eine quantitative Bestimmung aller Inhaltsstoffe ermöglicht.

2D-HPLC deckt verschiedene Substanzgruppen ab

Bei der Entwicklung einer analytischen Methode für die verschiedenen Substanzgruppen bietet es sich an, einen komprehensiven HPLC-Ansatz zu wählen. Durch die Kombination von zwei unterschiedlichen Trennselektivitäten in der ersten und zweiten Dimension, wird eine deutlich bessere Trennung und Auflösung der einzelnen Peaks erzielt als in einer konventionellen eindimensionalen Messung. Dadurch gelingt in nur einer LCxLC-Analyse die Bestimmung der verschiedenen Inhaltsstoffe aus den unterschiedlichen Substanzgruppen. Der Aufbau des verwendeten comprehensive HPLC-Systems Nexera-e ist in Abbildung 2 illustriert.

Die Trennung mit diesem System wird auf zwei in Serie geschalteten Trennsäulen erreicht, mit zwischengeschalteten 6-Positionen-2-Wege-Ventilen. Hierbei werden kontinuierlich Fraktionen der ersten Dimension in Probenschleifen gesammelt und auf die schnellere zweite Dimension übertragen. Durch dieses kontinuierliche „Heart-cutting“ wird die Probe durch zwei verschiedene Säulen und somit unterschiedliche Selektivitäten geführt.

Dieser Systemaufbau gewährleistet, dass jede Probenfraktion, die von der ersten in die zweite Dimension transferiert wird, exakt dieselbe Wegstrecke bis Erreichen des zweiten Säulenanfangs durchlaufen muss. Ein sehr langsamer und flacher Gradient in der ersten, kombiniert mit einem schnellen UHPLC-Gradienten in der zweiten Dimension, ermöglicht dass alle Komponenten auf der zweiten Säule eluieren, bevor die nächste Fraktion auf diese injiziert wird.

HPLC-Säulen mit unterschiedlichen Selektivitäten

In einer komplexen Probenmischung, wie in Schokolade, sind häufig neutrale neben lipophilen Komponenten zu finden, aber auch polare oder geladene Bestandteile. Bei der Methodenentwicklung für eine zweidimensionale chromatographische Trennung sollte man deshalb die Säulen so wählen, dass diese unterschiedliche Selektivitäten haben. Der einfachste Ansatz der Säulenauswahl ist eine Kopplung von zwei Umkehrphasen RPxRP; hierbei gibt es keine Probleme mit der Mischbarkeit der Eluenten oder mögliches Ausfallen von Salzen bei konzentrierten Pufferlösungen. Auch lässt sich durch die Auswahl unterschiedlicher Zusätze oder organischer Lösungsmittel die Selektivität zusätzlich beeinflussen.

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Für die Analyse der Inhaltsstoffe aus Schokolade wurde für die erste Dimension eine Säule mit kleinem Durchmesser ausgewählt, die hydrophobe Eigenschaften besitzt und somit die unpolaren Analyten länger festhält (ACE 3 Super C18, 150 x 1 mm, 3 µm). Die Säule der zweiten Dimension hingegen besitzt polare Eigenschaften und erhöht damit die Retention von polaren Analyten (ACE Excel 2 C18-Amide, 100 x 2,1 mm, 2 µm).

Für das Erstellen der Gradienten für die erste und zweite Dimension ist es wichtig, den kontinuierlichen langsamen Gradientenanstieg der ersten Dimension auch für den Gradienten der zweiten Dimension zu berücksichtigen. Wie in Abbildung 3 ersichtlich, gibt es hierfür eine moderne LCxLC-Assist-Software, die es ermöglicht, die Startbedingungen des Gradienten der zweiten Dimension über die ganze Analyse dynamisch anzupassen.

In der Entwicklung der zweidimensionalen analytischen Methode für die Bestimmung der Inhaltsstoffe von Schokolade, wurden die separaten Gradiententrennungen optimiert und mithilfe der LCxLC-Software kombiniert.

Analytische Methode der comprehensive LCxLC

Die Trennung in der ersten Dimension erfolgte nach folgender Methode:

• Säule: ACE 3 Super C18, 150 x 1 mm, 3 µm

• Eluenten: A: 10 mM HCOONH₄, pH 2,8; B: 10 mM HCOONH₄, pH 2,8 in MeOH/H₂O (90:10)

• Flussrate: 0,01 ml/min

• Temperatur: 42 °C

• Gradient: 25% B (0 min) – 100% B (60 min) – 100% B (69 min) – 25% B (70 min) – 25% (90 min)

Die Trennung in der zweiten Dimension erfolgte nach folgender Methode:

• Säule: ACE Excel 2 C18-Amide, 100 x 2,1 mm, 2 µm

• Eluenten: A: 10 mM HCOONH₄, pH 2,8; B: 10 mM HCOONH₄, pH 2,8 in MeCN/H₂O (90:10)

• Flussrate: 1,2 ml/min

• Temperatur: 42 °C

• Gradient: 5% B (0 min) – 85% B (1,50 min) – 5% B (1,51 min) – 5% B (2,00 min)

PDA-Detektor für die Analyse der Standardmischung

Für die Analyse der Standardmischung wurde ein Photodiodenarray-Detektor verwendet. Die Visualisierung der aufgenommenen chromatographischen Daten erfolgt mithilfe der Chromsquare-Software in einem zweidimensionalen „Contour-plot“ (s. Abb. 4). Hierbei sind die einzelnen Substanzen als so genannte Blobs zu sehen. Abbildung 4 zeigt eine Standardinjektion mit den möglichen Inhaltsstoffen Saccharin, Theobromin, Catechin, Theophyllin, Chlorogensäure, Epicatechin, Koffein, Vanillin, Aspartam, Ethylvanillin, Guaiacol, Quininsulfat, Quercetin, Ethylparaben, Benzoesäure, Sorbensäure, Methylparaben, Propylparaben und Eugenol. Auch eine dreidimensionale Darstellung der getrennten Peaks ist möglich.

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Die Probenvorbereitung der Schokoladenprobe bestand aus einer Entfettung mit anschließender Extraktion der Inhaltsstoffe in ein für die HPLC geeignetes Lösungsmittel.

2 g der dunklen Chili-Schokolade wurden zweimal mit jeweils 15 ml n-Hexan für 10 min im Ultraschallbad bei 30 °C entfettet. Diese Mischung wurde für 10 min bei 6000 rpm zentrifugiert und der entstehende fetthaltige Überstand verworfen. Der Rückstand wurde an der Luft getrocknet, mit einer Mischung aus Aceton, Wasser und Essigsäure (70:29,8:0,2 v/v/v) aufgenommen und erneut für 15 min im Ultraschallbad belassen. Anschließend wurde die Probe filtriert und auf 40 °C aufgeheizt, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die verbleibende wässrige Phase wurde filtriert und für die LCxLC-Analyse benutzt.

LC/MS/MS-Detektor – elektiver und empfindlicher

In Abbildung 5 ist das Ergebnis der Chili-Schokoladen-Analyse gezeigt. Hierbei reichte die Empfindlichkeit eines PDA-Detektors nicht mehr aus, deshalb wurde die Analyse der Shimadzu Chili-Schokolade mithilfe eines Splitters vor dem Triplequadrupol LC/MS/MS-Detektor (LCMS-8040) durchgeführt.

Nach Optimieren der beiden Gradientenmethoden für über 20 enthaltende Komponenten mit unterschiedlichen chemischen Strukturen und Eigenschaften, konnten alle Substanzen in einer zweidimensionalen LCxLC-Methode getrennt werden. Diese einfache und empfindliche UHPLC/LCMS-Methode ermöglicht das gleichzeitige Bestimmen von Polyphenolen, Methylxanthinen, Süßstoffen, Aromastoffen und Konservierungsstoffen in dunklen Schokoladenprodukten.

* Dr. B. Bollig, Dr. G. J. Schad: Shimadzu Europa GmbH, 47269 Duisburg

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