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GSDIM Weitfeld-Höchstauflösung mittels Lokalisationsmikroskopie

| Autor / Redakteur: Marko Lampe* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte in der Vergangenheit große Fortschritte in der Biologie. Bislang war allerdings die Bildauflösung durch physikalische Grenzen eingeschränkt. Neue Methoden wie die der Lokalisationsmikroskopie setzen neue Maßstäbe, indem sie diese Einschränkungen umgehen.

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Abb. 1: Weitfeld versus GSDIM. Ptk2-Zellen. NPC-Färbung: anti-NUP153/Alexa Fluor 532. Microtubuli-Färbung: anti-β-Tubulin/Alexa Fluor 647. Mit freundlicher Genehmigung von Wernher Fouquet, Leica Microsystems in Zusammenarbeit mit Anna Szymborska und Jan Ellenberg, EMBL, Heidelberg, Deutschland
Abb. 1: Weitfeld versus GSDIM. Ptk2-Zellen. NPC-Färbung: anti-NUP153/Alexa Fluor 532. Microtubuli-Färbung: anti-β-Tubulin/Alexa Fluor 647. Mit freundlicher Genehmigung von Wernher Fouquet, Leica Microsystems in Zusammenarbeit mit Anna Szymborska und Jan Ellenberg, EMBL, Heidelberg, Deutschland
(Bild: Leica Microsystems)

Neue Verfahren in der Fluoreszenzmikroskopie setzen neue Maßstäbe bezüglich ihrer Auflösung und bieten damit völlig neue Möglichkeiten für ihren Einsatz in der Forschung. Ground State Depletion followed by individual molecule return (GSDIM) ist ein Verfahren der Lokalisationsmikroskopie, mit dem Strukturen bis hinab zu 20 nm aufgelöst werden können. Es ermöglicht die Erforschung der Struktur einzelner Proteine und Biomoleküle in Zellen sowie die Beobachtung molekularer Prozesse. Zu den wichtigsten Vorteilen der GSDIM-Methode gegenüber anderen Lokalisationsverfahren zählt ihre Anwendbarkeit mit üblichen Fluoreszenzmarkern, die standardmäßig in der biomedizinischen Forschung eingesetzt werden.

Die Lokalisationsmikroskopie

Die Auflösung eines Bildes im Fluoreszenzmikroskop ist beugungsbedingt auf etwa die Hälfte der Wellenlänge des emittierten Lichts begrenzt. Um enger nebeneinander liegende fluoreszenzmarkierte Strukturen getrennt zu erfassen, ist eine Technik erforderlich, die die Abbesche Auflösungsgrenze überwindet. Die häufigsten Höchstauflösungsverfahren zur Abbildung jenseits der Beugungsgrenze sind die Lokalisationsmikroskopie, SIM (Structured Illumination) sowie STED (Stimulated Emission Depletion).

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Allgemein ausgedrückt misst man bei der Lokalisationsmikroskopie nicht ein Ensemble gleichzeitig emittierender Fluorophore, sondern klar getrennte einzelne Fluorophore, die mit Nanometer-Genauigkeit lokalisiert werden können. Mit der Zeit wird die Position jedes Fluorophors bestimmt, der eine biologische Struktur markiert. Das Gesamtbild wird daraufhin aufgrund der Positionsinformation der jeweiligen Fluorophore in silico rekonstruiert. Dabei besteht die Herausforderung darin, Fluorophore aus einem Ensemble zu singularisieren, sodass einzelne Moleküle nachgewiesen werden können.

Das GSDIM-Verfahren

Im GSDIM-Verfahren geht es darum, die Mehrzahl der Fluorophore vorübergehend „auszuschalten“, damit andere, einzelne Fluorophore präzise lokalisiert werden können. Dazu wird Anregungslicht hoher Intensität so eingesetzt, dass nahezu alle Fluorophore der Probe in einen nicht fluoreszierenden Zustand überführt werden und nur einzelne, gut getrennte Fluorophore Fluoreszenz emittieren. Dies ist die Voraussetzung für eine nanometergenaue Lokalisierung (s. Abb. 1).

Molekulare Zustände

Wird eine fluoreszierende Probe durch (Laser-)licht angeregt, werden Elektronen durch Photonen in den ersten angeregten Zustand katapultiert. Bei der Rückkehr vom ersten Zustand in den Grundzustand wird energieärmeres Licht (langwelliges) emittiert.

Eine höhere Laserleistung erhöht die Zahl der Photonen, die ein Elektron im Grundzustand treffen und es in den angeregten Zustand versetzen können. Folglich zirkulieren mehr Elektronen in der Probe zwischen dem Grundzustand und dem angeregten Zustand in einem bestimmten Zeitraum. Die Zahl der emittierten Photonen nimmt zu und die Probe erscheint heller. Eine weitere Zunahme des Anregungslichts (beispielsweise von einer Hochleistungs-Laserquelle) kann zu einer Reduzierung der Fluoreszenzemission und dadurch zu einer schwächeren Probenabbildung führen.

Zunächst erhöht sich durch die Zunahme des Anregungslichts die Zahl von Elektronen, die zwischen dem Grundzustand und dem ersten angeregten Zustand zirkulieren. Vom angeregten Zustand geht ein gewisser Anteil der Elektronen in den Off-Zustand über (s. Abb. 1). Der einzige zugängliche Off-Zustand vom ersten angeregten Zustand ist der Triplet-Zustand. Um diesen Zustand zu erreichen, ist eine Spin-Umkehr des Elektrons notwendig. Solch eine Spin-Umkehr hat jedoch eine extrem niedrige Auftrittswahrscheinlichkeit und ist daher ein äußerst seltenes Ereignis. Folglich ist der Off-Zustand bei niedriger Lichtbestrahlung der Probe praktisch unbesetzt.

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