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GSDIM

Weitfeld-Höchstauflösung mittels Lokalisationsmikroskopie

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Off-Zustände haben eine lange Lebensdauer (im Bereich von µs bis s) und Fluorophore mit Elektronen im Off-Zustand können an der Fluoreszenzemission nicht mehr teilnehmen. Im Verlauf der Zeit geraten immer mehr Elektronen in den Off-Zustand, und die Helligkeit der Probenabbildung nimmt ab, obwohl die Gesamtzahl der Fluorophore gleich geblieben ist. Nur die Zahl der „aktiven“ beziehungsweise „zugänglichen“ Fluorophore hat sich geändert.

Das „Pumpen“ von Elektronen in den Off-Zustand kann als reversibler Schalter angesehen werden. Während das Elektron im Off-Zustand verweilt, wird der Fluorophor als ausgeschaltet betrachtet. Sobald das Elektron zum Grundzustand zurückkehrt, wird der Fluorophor „aktiv“ geschaltet und kann wieder Fluoreszenzlicht emittieren.

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Alle Übergänge zwischen molekularen Elektronenzuständen sind wahrscheinlichkeitsbedingte Prozesse. Daher kann das genaue Auftreten eines Übergangs für ein bestimmtes Elektron nicht vorhergesagt werden.

Nanometergenau lokalisieren

Für die Höchstauflösungsabbildung wird die Probe solange mit hoher Laserleistung bestrahlt, bis nur noch wenige Fluorophore im Sehfeld Photonen emittieren. Die Elektronen dieser „aktiven“ Fluorophore können bis zu einigen Tausend mal zwischen dem Grundzustand und dem ersten angeregten Zustand zirkulieren und dabei einen Photon-burst erzeugen, bevor sie wieder in den Off-Zustand zurückkehren. Der Photon-burst wird mit einer hochempfindlichen EMCCD-Kamera (electron multiplying charge-coupled device) aufgenommen.

Zudem verweilen nur wenige Elektronen für eine kurze Zeit im Grundzustand. Daraus entsteht die Situation der „ground state depletion with individual molecule return” (GSDIM). In der Regel sind Fluorophore, die Photon-bursts emittieren, räumlich gut getrennt. Daher können alle Photonen in einem bestimmten Bereich einem einzigen Molekül zugeordnet werden. So entspricht die Mitte des aufgenommenen beugungsbegrenzten Signals der Position des Fluorophors. Diese kann bis auf einige Nanometer genau berechnet werden.

Organische Fluorophore

Die endgültige Auflösung eines höchstauflösenden Systems hängt von zwei Faktoren ab, und zwar a) von der Genauigkeit der Lokalisation jedes einzelnen Fluorophors und b) von dem Mindestabstand zwischen den einzelnen Fluorophoren, die die zu untersuchende Struktur markieren (Färbungsdichte). Die Färbungsdichte kann z.B. durch höhere Antikörperkonzentrationen, die im Zuge der Immunfärbung verwendet werden, beeinflusst werden. Die Genauigkeit der Lokalisation hingegen hängt von der Zahl der Photonen ab, die von einem einzelnen Fluorophor mit einem Mikroskop gesammelt werden, und kann mit der folgenden Formel annähernd berechnet werden:

Quelle: Leica Microsystems
Quelle: Leica Microsystems

Δr: Beugungsgrenze des Mikroskops/ObjektivsN: Zahl der Photonen, die durch ein individuell lokalisiertes Fluorophor emittiert werdenΔrSMS: Lokalisationsgenauigkeit des einzelnen Fluorophors

Um also eine Lokalisationsgenauigkeit von 10 nm zu erreichen, müssen 400 Photonen eines Fluorophors mit einem Mikroskop gesammelt werden, das eine beugungsbegrenzte Auflösung von 200 nm liefert. Die Zahl der emittierten Photonen ist in der ersten Instanz eine Eigenschaft des Fluorophors im Zusammenhang mit dem Einbettmedium.

In der Regel bieten organische Fluorophore eine größere Helligkeit und Photostabilität als fluoreszierende Proteine. Folglich ist die von diesen Farbstoffen gelieferte Photonenzahl viel höher und die Lokalisationsgenauigkeit deutlich verbessert. Dadurch kann schließlich mit „stärkeren“ Farbstoffen wie organischen Fluorophoren eine höherauflösende Abbildung erzielt werden. n

* Dr. M. Lampe: Leica Microsystems, 35578 Wetzlar

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