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Automatisierung von zellbasierten Assays Wellness-Tempel für Zellen: Inkubator im Test

Ein Gastbeitrag von Lena Schober et al.* Lesedauer: 6 min |

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INHECO Industrial Heating & Cooling GmbH
Greiner Bio-One GmbH
Dr. Klinkner & Partner GmbH
CANDOR Bioscience GmbH

Zellkultivierung ist eine komplexe Aufgabe, bei der eine präzise Kontrolle der Parameter entscheidend ist. Wie dies praktisch und automatisiert gelingt, zeigt ein Inkubatortest am Fraunhofer Institut für Produktionstechnik und Automatisierung.

Abb.1: Auch Zellen wollen umsorgt werden. In Inkubatoren bekommen sie sozusagen das Pendant zu einer Wellness-Behandlung: eine ideale Wohlfühl-Kombi aus Temperatur, Feuchtigkeit Licht usw.
Abb.1: Auch Zellen wollen umsorgt werden. In Inkubatoren bekommen sie sozusagen das Pendant zu einer Wellness-Behandlung: eine ideale Wohlfühl-Kombi aus Temperatur, Feuchtigkeit Licht usw.
(Bild: © timofeev, vipman4 - stock.adobe.com; [M]VCG)

Einer der wichtigsten Schritte in automatisierten Zellkulturprozessen ist die Inkubation in einer kontrollierten Umgebung. Ein Team am Fraunhofer Institut für Produktionstechnik und Automatisierung (IPA) hat einen Zellinkubator für die Laborautomatisierung der Firma Inheco für die automatisierte Zellkultur und zelluläre Assays durch Integration in einen automatisierten Arbeitsablauf validiert. Der „SiLA-based Cell Incubator for Lab Automation“, kurz Scila, kann über den Kommunikationsstandard SiLA in verschiedene Liquid-Handling-Plattformen integriert werden. Den Ablauf der Validierung und deren Ergebnisse werden im Folgenden geschildert.

Testaufbau

Zunächst wurden Zellproliferationstests durchgeführt, um die Funktionalität des Inkubators für die Zellexpansion nachzuweisen (s. Infokasten zu Zellproliferation). Dazu kultivierten die Prüfer verschiedene Zelltypen (HEK293, HMSC.BM) in 6-Well-Platten über einen Zeitraum von drei Wochen und analysierten sie in regelmäßigen Abständen. Sowohl die Zellmorphologie als auch der Konfluenzgrad wurden mikroskopisch dokumentiert. Bei Erreichen von 80 Prozent Konfluenz wurden die Zellen passagiert und die Zellzahl und Lebensfähigkeit bestimmt. Als Referenz diente der gleiche Kulturaufbau in einem manuellen Inkubator (Heracell VIOS 250i, Thermo Scientific).

Des Weiteren wurde als typischer Anwendungsfall ein automatisierter zellbasierter Assay durchgeführt, indem der Scila (Bild: online) in einem Arbeitsablauf zusammen mit einem Roboterarm (Precise Automation) verwendet wurde, um den Inkubator mit einem Liquid-Handling-System (Fluent, Tecan) und den Analysegeräten (Cytation 5, Biotek; Glomax Discover, Promega) zu verbinden. HEK293-Zellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät und mit 0,5- bis 20-prozentiger DMSO-Lösung behandelt. Nach 24 Stunden wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe der Cell-Titer-Glo-Reagenz und einer Lumineszenzmessung bestimmt. Als Referenz wurde der gleiche Kulturaufbau in einem manuellen Inkubator durchgeführt. Anschließend wurde ein Reinigungs- und Desinfektionsprotokoll erstellt und getestet.

Zellproliferation

Zellteilung (Vermehrung) und Zellwachstum werden unter dem Begriff Zellproliferation zusammengefasst. Sie lässt sich über verschiedene Methoden bestimmen. So kann z. B. ein membrangängiger Stoff genutzt werden, der in den Zellen zu einem nicht mehr membrangängigen Farbstoff metabolisiert wird. Dieser Metabolit lässt sich kolorimetrisch bestimmen und über eine Eichkuve mit der Zellproliferation korrelieren. In anderen Assays nutzt man in die Zell-DNA eingebaute Radioisotope oder zellbindende Fluoreszenzfarbstoffe zur Messung der Zellproliferation.

Ergebnisse

Nachdem die vergleichenden Tests abgeschlossen waren, werteten die Experten des Fraunhofer IPA die Ergebnisse aus. Die kritischen Parameter in Zellkulturprozessen sind Temperatur und Feuchtigkeit. Daher sind der Initialisierungsprozess, die Gleichmäßigkeit über alle vier Kulturplattenpositionen und die Erholungszeit Schlüsselfaktoren, um ausgezeichnete stabile Kulturbedingungen innerhalb des Instruments zu gewährleisten. Wie diese Kriterien im Einzelnen von dem Testgerät erfüllt werden, ist hier zusammengefasst.

Initialisierungsprozess

Abb.2: Temperatur-Initialisierung bei 37 °C: Auf der x-Achse ist die Inkubationszeit [Minuten] und auf der y-Achse die Inkubationstemperatur [°C] aufgetragen. Die Messung der Lufttemperatur wurde mit zwei Sensoren durchgeführt, die in Schublade 2 positioniert waren (gezeigt ist der Durchschnitt).
Abb.2: Temperatur-Initialisierung bei 37 °C: Auf der x-Achse ist die Inkubationszeit [Minuten] und auf der y-Achse die Inkubationstemperatur [°C] aufgetragen. Die Messung der Lufttemperatur wurde mit zwei Sensoren durchgeführt, die in Schublade 2 positioniert waren (gezeigt ist der Durchschnitt).
(Bild: Inheco)

In einer normalen Laborumgebung wird die spezifizierte Feuchtigkeitsschwelle von >85 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit im Inneren des Geräts nach ~25 Minuten erreicht, und die Ziellufttemperatur von 37 °C ±1 °C nach etwa 19 Minuten (s. Abb. 2, Starttemperatur 22 °C, mit vorgefülltem Wasser (22 °C), ohne CO2, gemessen in Luft mit zwei Temperatursensoren in Schublade 2).

Uniformität

Abb.3: Homogenitätsmessung in den vier Schubladen des Inkubators: Für die Homogenitätsmessung wurden Inheco-Messplatten (IMP) – eine in jeder Schublade – verwendet. Die verschiedenen Plattenpositionen sind nummeriert, und zwar von unten (Position 1) nach oben (Position 4). Dargestellt ist der Durchschnittswert für jede Schublade, der von zehn in der IMP verteilten Sensoren ermittelt wurde.
Abb.3: Homogenitätsmessung in den vier Schubladen des Inkubators: Für die Homogenitätsmessung wurden Inheco-Messplatten (IMP) – eine in jeder Schublade – verwendet. Die verschiedenen Plattenpositionen sind nummeriert, und zwar von unten (Position 1) nach oben (Position 4). Dargestellt ist der Durchschnittswert für jede Schublade, der von zehn in der IMP verteilten Sensoren ermittelt wurde.
(Bild: Inheco)

Im stationären Zustand zeigen die Temperaturprofile eine hohe Homogenität in der Inkubationskammer mit einer maximalen Abweichung von 0,5 K zwischen den vier Plattenpositionen (s. Abb. 3). Das Design der Inkubationskammer ist so ausgelegt, dass über einen Temperaturgradienten in der Kammer ein passiver Ventilationskreislauf erzeugt wird, um die Feuchtigkeit gleichmäßig zu verteilen. Ein zusätzlicher Lüfter ist nicht erforderlich. Die Temperaturhomogenität beträgt 0,3 K in der jeweiligen Plattenposition.

Temperaturausgleich

Abb.4: Temperaturwiederherstellung nach Öffnen der Schublade: Die Temperaturerholung wurde hier in der Luft gemessen, wobei zwei Sensoren in Schublade 2 positioniert waren (der Graph zeigt den Durchschnittswert).
Abb.4: Temperaturwiederherstellung nach Öffnen der Schublade: Die Temperaturerholung wurde hier in der Luft gemessen, wobei zwei Sensoren in Schublade 2 positioniert waren (der Graph zeigt den Durchschnittswert).
(Bild: Inheco)

Nach dem Öffnen jeder der vier Schubladen für zehn Sekunden wurde die Regenerationszeit sowohl in der Luft (leerer Inkubator, s. Abb. 4) als auch mit vier Inheco Messplatten (IMPs) gemessen. Die IMP ist so entwickelt worden, dass sie eine ähnliche Wärmekapazität aufweist wie eine typisch gefüllte Zellkulturplatte (s. Abb. 5).

Abb.5: Temperaturwiederherstellung nach Öffnen der Schublade: Die Temperaturerholung wurde auch mit vier IMPs – eine in jeder Schublade – gemessen. Die verschiedenen Plattenpositionen sind nummeriert von unten (Position 1) bis oben (Position 4). Für jede Schublade ist der Durchschnittswert angegeben, der aus zehn in der Inheco Mess-Platte (IMP) verteilten Sensoren gewonnen wurde.
Abb.5: Temperaturwiederherstellung nach Öffnen der Schublade: Die Temperaturerholung wurde auch mit vier IMPs – eine in jeder Schublade – gemessen. Die verschiedenen Plattenpositionen sind nummeriert von unten (Position 1) bis oben (Position 4). Für jede Schublade ist der Durchschnittswert angegeben, der aus zehn in der Inheco Mess-Platte (IMP) verteilten Sensoren gewonnen wurde.
(Bild: Inheco)

In beiden Versuchsreihen sorgt das Scila-Design dafür, dass die Temperatur immer im vorgegebenen Bereich von 37 °C ±1 °C bleibt. Während das System sich dem Temperaturgleichgewicht nähert, trat keine kritische Überhitzung auf. Eine Abkühlung der Platten durch Entladen/Beladen und entsprechende Erholungszeiten, wie sie bei manuellen Inkubatoren zu beobachten sind, gibt es bei dem Gerät nicht, sodass optimale Kulturbedingungen für die im Inkubator verbleibenden Platten gewährleistet sind.

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Zellexpansion

Abb.6: HEK293-Zellen (l.) und HMSC.BM-Zellen nach 21 Tagen Wachstum
Abb.6: HEK293-Zellen (l.) und HMSC.BM-Zellen nach 21 Tagen Wachstum
(Bild: Inheco)

Die Zellexpansion zeigte im getesteten Inkubator bei allen Analyseschritten ähnliche Ergebnisse wie bei der Referenz in einem manuellen Standard-Inkubator. Sowohl HEK293 als auch die empfindlichen humanen knochenmarkstämmigen mesenchymalen Stammzellen (HMSC.BM) zeigten eine typische Zellmorphologie und eine hohe Lebensfähigkeit von über 80 Prozent während mehrerer Subkultivierungsschritte über drei Wochen (s. Abb. 6 und 7). Darüber hinaus waren die Verdopplungszeiten für die HEK293-Zellen zwischen dem Referenzinkubator und dem Scila über den gesamten Kultivierungszeitraum vergleichbar; die Ergebnisse stehen im Einklang mit Literaturdaten [1,2]. Die Verdopplungszeiten für HMSC.BM waren ebenfalls in beiden Systemen vergleichbar und stimmen mit Literaturdaten überein [3].

Reinigung und Desinfektion

Abb.7: Lebensfähigkeit von HEK293-Zellen (l.) und HMSC.BM-Zellen (r.) über einen Zeitraum von drei Wochen
Abb.7: Lebensfähigkeit von HEK293-Zellen (l.) und HMSC.BM-Zellen (r.) über einen Zeitraum von drei Wochen
(Bild: Inheco)

Der Inkubator wurde zur Reinigung in den Wartungsmodus versetzt, Schubfächer und Klappe wurden entfernt und das Gerät wurde zwei Stunden lang offengelassen, um es mit Raumluft zu belüften. Nach Entfernung des Wassers wurde es mit milder Seifenlauge gereinigt und anschließend dreimal mit 70-prozentigem Ethanol desinfiziert. 30 Minuten später wurde das Gerät zusammengebaut und in Betrieb genommen. Die Sterilität wurde mit Agar-Kontaktplatten nachgewiesen. Proben wurden vor und nach der Reinigung und Desinfektion an kritischen Kontrollpunkten wie Boden, Rückwand, Schublade, Fronttür und Isoliergummis genommen. Die Kontakt-Agarplatten wurden anschließend 14 Tage lang bei 30 °C bebrütet und zeigten nach dem beschriebenen Reinigungsverfahren in beiden Geräten, dem Referenzbrutschrank und dem Scila, keinerlei Wachstum. Im Gegensatz dazu, zeigten Proben, die vor der Reinigung und Desinfektion entnommen wurden, als Positivkontrolle ein Mikrobenwachstum. Darüber hinaus wurden 6-Well-Agarplatten 14 Tage lang ohne Deckel in dem gereinigten und desinfizierten Scila bebrütet. Es wurde keine Kontamination festgestellt.

Zusammenfassung

Der Inkubator von Inheco zeigte sich in dem Test durch das Fraunhofer IPA als ein zuverlässiges System zur Inkubation von Zellen in einer automatisierten Infrastruktur. Das kompakte System lässt sich in viele Liquid-Handling-Systeme integrieren. Über den SiLA-Kommunikationsstandard lässt es sich einfach in eine Prozessmanagement-Software (z. B. Lab Automation Control Suite, LACS) integrieren.

Abb.9: Inkubatoren-Vergleich: Die Grafik zeigt auf der x-Achse die Behandlungsbedingungen und auf der y-Achse die mit dem Cell-Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay gemessenen relativen Lumineszenzeinheiten (RLU). UTC: Unbehandelte Zellkontrolle (auf 100% eingestellt), DMSO: Behandlung mit einer Konzentration von 1 bis 20 Prozent. NC: Negativkontrolle. Graue Balken: manueller Referenz-Inkubator; blaue Balken: Scila-Inkubator. sechs Kavitäten in vier verschiedenen Platten wurden für jede Behandlung im Scila bearbeitet; sechs Kavitäten für jede Behandlung in einer Platte wurden als Referenz bearbeitet.
Abb.9: Inkubatoren-Vergleich: Die Grafik zeigt auf der x-Achse die Behandlungsbedingungen und auf der y-Achse die mit dem Cell-Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay gemessenen relativen Lumineszenzeinheiten (RLU). UTC: Unbehandelte Zellkontrolle (auf 100% eingestellt), DMSO: Behandlung mit einer Konzentration von 1 bis 20 Prozent. NC: Negativkontrolle. Graue Balken: manueller Referenz-Inkubator; blaue Balken: Scila-Inkubator. sechs Kavitäten in vier verschiedenen Platten wurden für jede Behandlung im Scila bearbeitet; sechs Kavitäten für jede Behandlung in einer Platte wurden als Referenz bearbeitet.
(Bild: Inheco)

Das Fraunhofer-Team demonstrierte in den Tests die Eignung des Inkubators für die Zellkultur sowohl für die HEK293-Zelllinie als auch für die empfindlichen HMSC.BM. Weiterhin wurde die automatisierte Durchführung eines zellulären Assays demonstriert. Ein Reinigungs- und Desinfektionsprotokoll wurde erfolgreich erprobt.

All diese Ergebnisse unterstreichen, dass sich das Scila-System für die automatisierte Durchführung von zellbasierten Assays eignet. (clu)

Referenzen:

[1] Cervera, Laura et al., 2011. Optimierung des HEK 293-Zellwachstums durch Zugabe von nicht-tierischen Bestandteilen unter Verwendung von Versuchsplänen. BMC proceedings 5 Suppl 8, P126 DOI: 10.1186/1753-6561-5-S8-P126

[2] Zhang, Xun et al. (2015). Intrazelluläre Konzentrationen bestimmen die Zytotoxizität von Adefovir, Cidofovir und Tenofovir. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA 29 (1), pp. 251-258 DOI: 10.1016/j.tiv.2014.10.019

[3] Yang, Yueh-Hsun, Kevin et al. (2018). Veränderungen des Phänotyps und des Differenzierungspotenzials humaner mesenchymaler Stammzellen bei der Alterung in vitro. Stem cell research & therapy 9 (1), S. 131 DOI: 10.1186/s13287-018-0876-3

[4] Xia, Menghang et al. (2008). Erstellung von Zytotoxizitätsprofilen von Verbindungen durch quantitatives Hochdurchsatz-Screening. Perspektiven der Umwelt und Gesundheit 116 (3), S. 284-291 DOI: 10.1289/ehp.10727

[5] Jamalzadeh, Leila et al. (2016). Zytotoxische Effekte einiger gebräuchlicher organischer Lösungsmittel auf MCF-7, RAW-264.7 und menschliche Nabelvenen-Endothelzellen. Avicenna Journal of Medical Biochemistry In press DOI: 10.17795/ajmb-33453

* Lena Schober, Richard Rösch, Moriz Walter, Andrea Traube, Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung IPA, 70569 Stuttgart; Martin Rotter, Herwig Angst, Martin Gajewski, Andreas Scholle, Christian George Inheco Industrial Heating and Cooling, 82152 Martinsried

(ID:49014450)

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