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HPLC Wie setzt man die Mischkammer in der HPLC ein?

Autor / Redakteur: Werner Röpke* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Viele Trennprobleme in der HPLC können nur durch die Gradientenelution gelöst werden. Um hier reproduzierbare Gradienten zu erzeugen, müssen Mischkammern eingesetzt werden. Welche Unterschiede gibt es bei den Mischkammern und worauf muss der Anwender achten?

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Abb.1: In der so genannten Mischkammer werden die beiden Lösemittel für die Gradienten-HPLC gemischt.
Abb.1: In der so genannten Mischkammer werden die beiden Lösemittel für die Gradienten-HPLC gemischt.
(Bilder: Techlab)

Mit dem Aufkommen der Gradientenelution in der HPLC-Analytik bestand die Notwendigkeit, zwei unterschiedliche Flüssigkeitsströme innig zu vermischen, bevor sie ihren Weg in der HPLC fortsetzen. Das Wesen der Gradientenelution bestand und besteht darin, die Elutionskraft des Laufmittels langsam im Laufe der Trennung zu erhöhen.

Bei zwei Pumpen ist das noch vergleichsweise einfach. Der Anwender lässt einfach eine Pumpe schneller und die andere langsamer laufen und verändert so die Geschwindigkeiten während des Laufes kontinuierlich, das so genannte Hochdruckgradientensystem.

Etwas problematischer wird es, wenn die Eluenten häppchenweise zugeteilt werden, wie es bei einem Niederdruckgradienten geschieht. Dabei handelt es sich natürlich auch um Hochdruckpumpen, doch die zwei, drei oder vier Laufmittel werden vor der Pumpe, also auf der Niederdruckseite, zugeführt. Aus diesem Grund hat sich dieser Name eingebürgert. Während der Saugphase der Pumpe schalten Magnetventile jeweils eine der bis zu vier Zuleitungen frei und formen auf diese Weise über die Laufzeit der Trennung ein Gradientenprofil.

Passive und aktive HPLC-Mischkammern

Die Ausgänge der beiden Pumpen bei Hochdruckgradientensystemen (schon aus Kostengründen keine drei oder gar vier) werden zusammengeführt. Im einfachsten Fall ist das ein T-Stück, in welchem sich dann Laufmittel A mit Laufmittel B irgendwie verquirlt und am Ausgang als einigermaßen homogenes Gemisch entlassen wird. Da aber bedingt durch winzige Druckschwankungen der Pumpen die hydraulischen Verhältnisse im T-Stück immer etwas instabil sind, schwankt auch die Mischung geringfügig in ihrer Zusammensetzung. Im besten Fall erhöht dies das Signal/Rauschen-Verhältnis der Messung, schlimmstenfalls zeigt sich eine deutlich sichtbare Wellenlinie in der UV-Absorbtion.

Zur Lösung dieses Problems orientierte man sich an den in Laboren üblichen Magnetrührern, verkleinerte diese und versah sie mit einem druckfesten Gehäuse.

Diese so genannten aktiven Mischer haben sich bis heute bewährt. Abbildung 2 links zeigt den typischen Aufbau: In einem Edelstahlgehäuse rotiert ein PTFE-ummantelter Rührfisch. Seine Abmessungen in horizontaler Rotatation definieren gleichzeitig das kleinstmögliche Kammervolumen. Die Eluenten treten am Boden der Kammer seitwärts ein, werden durchgequirlt und steigen nach oben. Dort ist die Kammer natürlich mit einem druckfesten Deckel verschlossen und hat einen Kapillaranschluss für das austretende Laufmittel, das nun dem Injektionsventil zugeführt werden kann.

„Alles, was sich dreht, ist aufwändig und kann kaputt gehen“, sagten sich manche Entwickler und sannen auf eine Möglichkeit, ohne Rührer auszukommen. Das einfache T-Stück hatte sich nicht so richtig bewährt. Also füllte man einen kleinen Edelstahltopf mit Glaskugeln und ließ die Eluenten sich ihren Weg durch die Hohlräume suchen (s. Abb. 2, rechts). Durch die häufige Richtungsänderung findet zwangsläufig eine Vermischung statt. Diese Bauart wird auch als passiver Mischer bezeichnet. Beide Systeme gibt es noch heute und manche Firmen führen beide Systeme nebeneinander im Programm. Sowohl Magnetrührer als auch Glaskugelmischer sind üblicherweise mit einer Fritte oder einem Edelstahlsieb abgeschlossen, aber dazu später.

Parallel zu diesen Mischern wurde auch an der T-Stück-Technologie weiterentwickelt, denn sie besitzt den großen Vorteil eines sehr kleinen Mischvolumens. Hierzu wurden einem T-Stück sozusagen die Arme nach unten gedrückt, zusätzlich wurden die beiden Zuleitungen eine Kleinigkeit versetzt angeordnet, sodass sich aus beiden Strömen ein kräftiger Wirbel ausbilden konnte. Unter dem Begriff Vortex-Mischer sind diese noch heute auf dem Markt.

Mit dieser Modifikation können hochdruckseitige Mischungen bei sehr kleinen Flussraten realisiert werden. Für die niederdruckseitige Mischung ist solch ein Mischer nicht geeignet, weil zwei aufeinander zu laufende Flüssigkeitsströme für die Funktion erforderlich sind. Passive Mischer mit Kugeln oder aktive Mischer mit Rührer können für beide Gradientenarten eingesetzt werden.

Wie groß soll die Mischkammer sein?

So, wie es dem Martini eher egal sein kann, ob der Gin mit dem Vermouth verrührt oder geschüttelt wurde, so ist auch die Methode der Mischung in der HPLC eher nebensächlich. Am Ende sollte nur das Ergebnis stimmen, nämlich eine möglichst schwankungsfreie, präzise Durchmischung. Die ungestörte, ruhige Basislinie sowie reproduzierbare Retentionszeiten sind für eine hohe Messempfindlichkeit erforderlich. Und nur, wenn zu jeder Zeit exakt die programmierte Eluentenzusammensetzung vorliegt, sind diese konstant.

Leider beißen sich gerade diese beiden Anforderungen ein wenig. Ein großes Volumen der Kammer garantiert eine gute Durchmischung, denn die Flüssigkeiten haben mehr Zeit sich zu treffen. Dafür geht allerdings die Präzision des Mischverhältnis verloren. Der Gradientenverlauf wird „unschärfer“. Das kann man an einem Stufengradienten sehr schön nachvollziehen. Hier wäre der Umstieg auf eine kleine Mischkammer angebracht.

Je geringer die Flussrate, desto kleiner muss das Mischkammervolumen sein. Ideal wäre also eine dynamisch verstellbare Kammer, die der jeweiligen Flussrate folgt. Die Firma LKB hatte so etwas ähnliches vor vielen Jahren an ihren Pumpen: Ein Glasrohr mit einem festen und einem verstellbaren Kolben. Dazwischen rotierte ein senkrecht stehender Rührfisch. Es hat sehr gut funktioniert, konnte sich aber nicht wirklich durchsetzen.

Aber bei statischen Mischkammern sind durchaus Kompromisse möglich: Bei Flussraten von 500 μl/min bis 2 ml/min für eine analytischen Kammer kommt man recht gut hin. Diese hat dann ein Volumen von ca. 300 bis 350 μl, was ausreichende Präzision des Gradienten bei niedrigem Rauschen garantiert; Ob statisch oder passiv gemischt, ist hier egal.

Wie sieht es bei Mikro-HPLC aus?

Für die Mikro-HPLC mit Flussraten um 50 oder 100 μl/min sind natürlich deutlich kleinere Kammern erforderlich. Dafür braucht es für präparative Anwendungen nicht unbedingt eine besonders große Kammer, da der sehr präzise Gradientenverlauf mit einer unruhigen Basislinie erkauft wird. Allerdings ist das bei Peaks, die man nicht auswerten, sondern nur sammeln will, ziemlich egal.

Um nochmal auf den Unterschied von hoch- und niederdruckseitige Gradientenformung zurück zu kommen: Bei der niederdruckseitigen Gradientenformung haben wir es mit kleinen, von den Magnetventilen vor der Pumpe erzeugten Flüssigkeitssegmenten zu tun, die vermischt werden müssen. Grundsätzlich gibt es keinen Unterschied zwischen den Mischern, nur muss das Kammervolumen bei der Niederdruckmischung mindestens ein dreifaches des kleinsten Flüssigkeitssegmentes betragen, das von den Magnetventilen während der Saugphase erzeugt werden kann. Bei mit Kugeln gefüllten Mischern ist die Berechnung des freien Volumens nicht ganz einfach, da es für die Packungsdichte von Kugeln nur eine Annäherung, aber keinen mathematischen Beweis gibt. Die „Kepler'sche Vermutung“ besagt, dass die mittlere Packungsdichte von gleichförmigen Kugeln maximal 74% beträgt, experimentell kommt man auf 65%. Bei einem gegebenen Gesamtvolumen einer Kammer von 1 000 µl wären also 350 µl Mischvolumen anzusetzen. Der Rest des Raumes wird von den Kugeln besetzt.

Um all diese Dinge muss sich der Anwender, der eine komplette HPLC als System aus einer Hand gekauft hat, zum Glück keine Gedanken machen. Er erhält vom Hersteller optimal aufeinander abgestimmte Komponenten. Wer allerdings fünf Geräte von sechs Herstellern besitzt, dem mögen diese Ausführungen sicher hilfreich sein.

Fritte als mögliche Verschmutzungsursache

Irgendwo in den Mischkammern oder kurz dahinter (mit Ausnahme der einfachen T-Stücke; Mixing tees) gibt es Siebe und Fritten, die verhindern sollen, dass Schmutz auf die Säule gelangt. Das ist gut gemeint, aber nicht unbedingt sinnvoll. In so einer Fritte sammelt sich schon mal der Dreck aus einer ganzen Anwendergeneration.

Irgendwann tauchen dann sehr merkwürdige Effekte im Chromatogramm auf und die ganze Anlage wird zerlegt – nur die Mischkammer nicht. Dabei würde ein Blick auf die Fritte oder das Sieb genügen: ausgefallene Verunreinigungen aus den Eluenten von tausenden Gradientenläufen haben sich hier festgesetzt und werden bei jeder neuen Analyse je nach Laufmittel abgelöst und erscheinen im Chromatogramm.

* W. Röpke: Techlab GmbH, 38118 Braunschweig

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