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FPLC-System für mehrstufige Aufreinigungen

Zeit und Ressourcen sparen durch automatisierte Proteinaufreinigung

Kennen Sie das auch? Sie haben Ihr Protein mühsam aufgereinigt und müssen das kostbare Gut dann auch noch „umpuffern“ oder in einem nachgelagerten Aufreinigungsschritt bearbeiten, um die gewünschte Reinheit zu erzielen. Egal ob über Dialyseschläuche oder SEC, jeder zusätzliche Schritt stellt eine Belastung für Ihre Proteine dar.

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(Bild: KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH)

Durch die manuelle Interaktion können sich Fehler einschleichen - es droht Probenverlust. Eine Automatisierung aller Aufreinigungsschritte reduziert die Fehlerquote und erhöht die Produktivität.

Aufreinigungen von Proteinproben können auf unterschiedliche Arten durchgeführt werden. Eine davon ist die Flüssigkeitschromatografie (Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC).

Da Proteine meist erst nach mehrstufigen Aufreinigungsschritten mit ausreichender Reinheit isoliert werden können, sind selbst bei FPLC-Verfahren manuelle Schritte notwendig. Die manuelle Interaktion kann durch einen durchdachten Systemaufbau und eine geschickte Methodenprogrammierung in der Software jedoch reduziert werden.

Automatisierte Proteinaufreinigung

Im ersten Trennungsschritt, zumeist eine Affinitätsaufreinigung, wird das Zielprotein von einer großen Menge anderer Proteine und Zellbestandteile getrennt. Dazu bedarf es einer hochspezifischen Bindung des Zielproteins an die verwendete Säulenmatrix. Diese kann zum Beispiel durch rekombinant an das Zielprotein klonierte Tags erzielt werden. Durch die spezifische Bindung werden Proteine, die diesen Affinitäts-Tag tragen, von der Säule retardiert und erst im Elutionsschritt freigesetzt. Alle anderen Verunreinigungen werden im „Flowthrough“ direkt abgetrennt. Das grob vorgereinigte Protein kann nach der Elution automatisiert in einem Proben-Loop gesammelt und auf eine weitere Säule ohne manuelle Interaktion injiziert werden. In diesem zweiten Schritt der Aufreinigung, welche meist die Größenausschluss-Chromatografie ist, kann das Protein dann in hoher Reinheit mittels eines Fraktionssammlers fraktioniert werden. Die mehrschrittige Chromatografie ist jedoch nicht auf diese beiden Methoden beschränkt. Es können beliebige Methodenarten aneinandergereiht werden, also auch Ionenaustausch-Chromatografie und Hydrophobe Interaktionschromatografie. Die einzige Einschränkung für diese Art der Automatisierung ist, dass nur beim finalen Schritt der Fraktionssammler eingesetzt werden kann.

Ventile – machen es möglich

Integraler Bestandteil dieser Prozessoptimierung sind Ventile, die den Flüssigkeitsstrom lenken. Es gibt verschiedene Arten von Ventilen, die bei der automatisierten Proteinaufreinigung helfen. In der in Abb. 1 gezeigten Beispielkonfiguration kommen drei verschiedene Ventile zum Einsatz. Durch ein Injektionsventil kann der Nutzer flexibel wählen, ob die Beladung mittels Probenpumpe oder Probenschleife erfolgen soll – je nach Volumen der jeweiligen Probe. Ein Säulenauswahlventil wiederum ermöglicht die sequenzielle Verwendung von spezifischen Säulen für jeden Aufreinigungsschritt. Wenn die getrennten Biomoleküle die Säule verlassen, werden sie mit Hilfe eines Fraktionierventils im ersten Trennungsschritt zurück in eine Probenschleife geleitet, die sich am Injektionsventil befindet, um die Probe erneut zu injizieren. Nach der zweiten Trennung kann die Probe dann in kleinen Volumina mittels des Fraktionssammlers fraktioniert werden. Das Signal des UV-Detektors steuert dabei das Fraktionierventil und gewährleistet somit die zielgenaue Sammlung des Proteins.

Abbildung 1: Fließschema eines Two Step Aufreinigungssystems
Abbildung 1: Fließschema eines Two Step Aufreinigungssystems
(Bild: KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH)

Neben dem AZURA® Two Step Purification System bietet Firma KNAUER eine große Bandbreite an FPLC-Systemen „Made in Germany“ in verschiedenen Dimensionen und Konfigurationen an. Die AZURA Bio Purification Systeme gibt es von einfach bis komplex, vom Lab bis zum Pilotmaßstab. Die modulare Bauweise ermöglicht es dem Kunden, das System nach seinen Bedürfnissen anzupassen. Eine Erweiterung um weitere Detektoren oder die Skalierung zum höheren Maßstab ist sehr einfach. Weitere Informationen zum FPLC-Portfolio von KNAUER finden Sie hier.

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