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STED-Mikroskopie und SIMS Zellbestandteile im Nanometer-Bereich analysieren

Autor / Redakteur: Angela Vogts*, Sinem Saka** und Silvio Rizzoli** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Forscher der Georg-August-Universität Göttingen und des Leibniz-Instituts für Ostseeforschung haben ihr Wissen in räumlich hoch aufgelöster Analytik kombiniert. Optische Analysen per STED-Mikroskopie und isotopische Messresultate per Sekundärionenmassenspektrometrie (SIMS) liefern Einblicke in den Stoffumsatz der einzelnen Zellorganellen.

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Abb. 2: Vergleich von klassischer Mikroskopie (konfokal) und STED-Mikroskopie
Abb. 2: Vergleich von klassischer Mikroskopie (konfokal) und STED-Mikroskopie
(Bild: Leibniz-Institut für Ostseeforschung/Universitätsmedizin Göttingen)

Wenn Forscher eine Zelle betrachten wollen, nutzen sie in der Regel ein Mikroskop. Aber wenn sie sich für kleinste Zellbestandteile interessieren, wie z.B. synaptische Vesikel, die Transportbehälter für Neurotransmitter in den Nervenzellen, dann erreicht die Standardmikroskopie ihre Grenze. Diese Grenze liegt, bedingt durch die Wellenlänge des Lichts, bei ca. 200 Nanometern. Synaptische Vesikel sind kleiner.

Blick in die Zelle – per STED-Mikroskopie

An der Georg-August-Universität in Göttingen werden daher die Vorgänge in Nervenzellen mit der so genannten STED-Mikroskopie untersucht. Diese Methode erlangte im vergangenen Jahr besondere Bekanntheit, da der Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung dieser Technik vergeben wurde. STED steht dabei für Stimulated Emission Depletion. Das Funktionsprinzip dieser Methode: Markersubstanzen werden in eine Zelle gebracht und mit Laserlicht einer bestimmten Wellenlänge stimuliert. Diese Anregung führt zur Emission von Licht, die aber von einem anderen ringförmigen Laserlicht zu einem großen Teil ausgelöscht wird (Depletion). Nur ein kleiner, zentraler Teil des von der Probe emittierten Lichts wird bis zum Detektor durchgelassen. Die Forscher schauen quasi wie durch eine Lochblende oder ein Schlüsselloch auf z.B. eine Zelle. Die Probe wird mit dieser Technik Punkt für Punkt analysiert und es ergibt sich ein Bild mit deutlich besserer Auflösung als bei herkömmlicher Mikroskopie. Durch Anwendung von an die Fragestellung angepassten Markersubstanzen kann die STED-Mikroskopie so z.B. aktive Zonen in einer Zelle identifizieren oder eben einzelne synaptische Vesikel sichtbar machen. Wie aktiv diese Zellbereiche sind, ob sie frisch gebildet wurden oder schon länger Teil der Zelle sind, vermag die STED-Mikroskopie aber nicht zu zeigen.

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Isotopische Analysen mit Sekundärionenmassenspektrometrie (SIMS)

Um die Aktivität von Zellen zu bestimmen werden Experimente mit stabilen Isotopen durchgeführt. So nutzen die Wissenschaftler z.B. 15N-Leucin, eine für höhere Organismen zum Leben notwendige Aminosäure, in der statt des natürlich häufig vorkommenden 14N das seltenere 15N gebunden ist. Eine Zelle erkennt keinen Unterschied und nutzt das 15N-Leucin wie das natürlich vorkommende. Um dieses 15N dann in den Zellen aufzuspüren, wird Sekundärionenmassenspektrometrie (SIMS) eingesetzt, in diesem Fall das NanoSIMS50L am Leibniz-Institut für Ostseeforschung in Warnemünde. Bei der SIMS werden Primärionen auf die Probe „geschossen“ dabei entstehen Sekundärionen, die durch das Sektorfeldmassenspektrometer entsprechend ihrer Masse getrennt werden. Bei den Sekundärionen handelt es sich in der Regel um mono- und diatomare Einheiten (C-, CN-). Dadurch wird es möglich, die Isotope eines Elements (z.B. 12C und 13C) einzeln zu detektieren und Verhältniswerte zu berechnen. Da zudem die Probe Pixel für Pixel gescannt werden kann, ergeben sich bei diesen Analysen ebenfalls Bildaufnahmen. Aufgrund der speziellen Ionenoptik reicht die laterale Auflösung in den Bereich der STED-Mikroskopie. Gearbeitet wird bei der Kombination der beiden Methoden mit in Harz eingebetteten Proben, von denen Dünnschnitte angefertigt werden. Die Wahl des richtigen Harzes mit passenden Eigenschaften für die STED-Mikrokopie (keine Fluoreszenz) und die SIMS (kein Stickstoffgehalt, hochvakuumfest) ist essenziell. Ebenso wie die Etablierung von exakter Dokumentation und Markierung der relevanten Bereiche mittels Laser. Nur so können die im STED gefundenen nanometergroßen aktiven Bereiche mit dem NanoSIMS, das mehrere 100 km entfernt an einem anderen Institut steht, analysiert werden.

Zellorganellen in neuronalen Axonen analysieren

Den Detailreichtum, der mit der Methodenkombination erreicht werden kann verdeutlicht folgendes Beispiel: Es wurde ein neuronales Axon untersucht, ein schlauchartiger Nervenzellfortsatz über den Signale von Zelle zu Zelle weitergeleitet werden. Durch die Anwendung verschiedener Färbemethoden wurden Mitochondrien, synaptische Vesikel und aktive Zonen lokalisiert. Das Vorhandensein von allen drei Organellen charakterisiert eine Synapse, den Übergangsbereich zu einer anderen Nervenzelle. Die NanoSIMS-Analysen dieses Bereichs zeigten, dass die Synapse deutlich mehr 15N-Leucin beinhaltet als das Axon. Weiterhin erkennt man bei detaillierterer Analyse mittels STED dort, wo die einfache Mikroskopie zwei aktive Bereiche unterscheiden kann, neun aktive Zonen, die deutlich stärkere Unterschiede in der Aktivität aufweisen. Eine hohes 15N/14N–Verhältnis bedeutet einen hohen Stoffumsatz. In dieser Synapse sind also aktive Zonen mit hohem und niedrigem Stoffumsatz unmittelbar benachbart. Dies ist eine Information, die mit keiner anderen Methode erhalten werden kann. Das Ergebnis bestätigt Vermutungen, dass in diesem Bereich die Zellbestandteile im Laufe der Zeit nach und nach erneuert werden und nicht alle Zellteile gleich „alt“ sind.

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Die Kombination dieser beiden Techniken ermöglicht es also, vom gleichen Zellbereich Informationen zu Identität (welche Zellorganelle liegt vor) und Aktivität (aus den Isotopenverhältnissen) zu erhalten. Dieses Verfahren ist nicht auf neuronale Zellen limitiert, sondern kann auf alle Zellarten wie Mikroorganismen und ihre Organellen ausgeweitet werden. Gerade in Zellbereichen in denen Organellen dicht zusammenliegen, ist es wichtig mittels STED-Mikroskopie genau zu bestimmen, welche Bereiche welchen Organellen zugeordnet werden, um die Aktivität exakt bestimmen zu können.

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Die Methodenkombination hat zudem Potenzial in der Ausweitung auf Isotope/Elemente. Bis zu sieben Massen kann das Nano-SIMS parallel detektieren, was genutzt werden könnte, um zu untersuchen, ob isotopische Anreicherungen von Kohlenstoff, Stickstoff und Schwefel in den gleichen Zellbereichen auftreten und die Umsetzung dieser Substanzen somit ggf. verknüpft sind. Weiterhin können, da die Korrelation der Methoden etabliert ist, auch weitere Techniken, wie die Elektronenmikroskopie in die Methodenkombination einbezogen werden.
Originalpublikation: Saka, S. K., Vogts, A., Kröhnert, K., Hillion, F., Rizzoli, S. O., Wessels, J., Correlated Optical and Isotopic Nanoscopy. Nature Communications 5, 2014, Article No. 3664.

* Dr. A. Vogts: Leibniz-Institut für Ostseeforschung, 18119 Rostock

* *Prof. Dr. S. Rizzoli, Dr. S. Saka: Universitätsmedizin, Georg-August-Universität, 37075 Göttingen

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