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Bildgebende Zytometer Zellbiologie: Reproduzierbarkeit und Präzision auch bei schwierigen Zellzählungen

Autor / Redakteur: Dr. Christoph Enz* / Dr. Ilka Ottleben

Zählen, was zählt: Für zahlreiche Anwendungen in Medizin und Life Sciences ist die Bestimmung der Zellzahl einer Probe sowie die Beurteilung bestimmter Zelleigenschaften wie der Viabilität oder Morphologie essenziell. Bildgebende Zytometer können dabei zur entscheidenden Präzision und Reproduzierbarkeit der Zellzählungen verhelfen.

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Abb. 1: Zellen sind vielgestaltig und ebenso die Matrizes, in denen sie zu bestimmen sind. Im Bild: Illustration einer mirkroskopischen Darstellung.
Abb. 1: Zellen sind vielgestaltig und ebenso die Matrizes, in denen sie zu bestimmen sind. Im Bild: Illustration einer mirkroskopischen Darstellung.
(Bild: ©Ivanc7 - stock.adobe.com)

Wie oft ist im zellbiologischen Laboralltag eigentlich eine schnelle und präzise Bestimmung der Zellzahl relevant? Genau genommen dauernd, oder? Dieser Frage sahen sich vor etwa einem Jahrzehnt Jean und Peter Li aus Boston gegenüber. Die beiden hatten ein damals ganz neues, aber eigentlich schlichtes Tool entwickelt: eine skalierte Hämocytometer-Kammer „zum Wegwerfen“, also aus Kunststoff und damit sehr günstig, um den eigentlichen Kostenfaktor Arbeitszeit zu minimieren, der aus dem wiederholten Waschen und zwangsläufigem Check der Sauberkeit erwuchs. Bei der Vorstellung dieser heute noch erhältlichen „disposable hemocytometer slides“ am NIH in Washington wurden sie dann mit einer weiteren Frage konfrontiert: ließe sich nicht diese Art der Zählung automatisieren? Denn in der manuellen Zählung stecke noch viel mehr Zeit und Arbeit, und außerdem könne man damit vielleicht die Variabilität bei der Zählung durch unterschiedliche Laboranten eingrenzen und damit eine viel bessere Reproduzierbarkeit erreichen?

Das war die Gründungsidee der Firma Nexcelom, denn Jean und Peter mit ihrem Background in Elektrotechnik und computergestützem Maschinenbau sahen das Potentzial und machten sich an die Arbeit. In der Zwischenzeit haben sie mit der Cellometer-Familie den Industriestandard für bildbasierte Zellzählung entwickelt und sorgen damit für einfache, schnelle und reproduzierbare Zellzählung. Und das vor allem auch dann, wenn es um komplexe Proben und empfindliche Zellen geht.

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Zellzählung mit bildgebenden Zytometern

Grundsätzlich handelt es sich dabei um kleine, automatisierte und für den Zweck optimierte Mikroskope. Man könnte auch von bildgebenden Zytometern sprechen. Und der fundamentale Vorteil von Bildern ist ja deren Dokumentationsvermögen: Man legt nicht nur eine Zahl nieder, sondern kann jederzeit auf die archivierten Bilder der Zellen zurückgreifen, um z.B. die Plausibilität einer Zählung zu überprüfen, selbst wenn diese lange zurückliegt.

Zellen sind vielgestaltig und ebenso die Matrizes

Aber warum gleich eine ganze Familie von Cellometern? Nun ja, Zellen sind vielgestaltig und ebenso sind die Matrizes, in denen sie zu messen sind, ganz unterschiedlich beschaffen. Man denke nur an verhältnismäßig einfache Zählungen von recht homogenen Kulturzellen im Vergleich zu relativ stark verschmutzten PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cell; dt.: mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) oder sogar Zählungen in Vollblut. Auch das Größenspektrum von sehr kleinen Blutplättchen oder Hefen bis zu „kräftigen“ Adipozyten bietet Herausforderungen. Schließlich sind die Anforderungen je nach Zertifizierung der Labors unterschiedlich und die Möglichkeit zur GLP-Zertifizierung erfordert einen anderen instrumentellen Aufwand als eine Messung im reinen Forschungsumfeld. Und schließlich ist die Zählung ja selten nur dies, sondern oft eben auch eine Quantifizierung der Viabilität, der Transfektionseffizienz oder sogar ein Assay zu Zellzyklus oder Apoptose.

Ergänzendes zum Thema
LP-Tipp – Manuelle Zellzählung

Die klassische manuelle Methode der Zellzählung erfolgt in einer Zählkammer auch Hämozytometer genannt, weil sie oft zur Bestimmung der Anzahl von Blutzellen zum Einsatz kommt. Die Grundplatte der Zählkammer besteht aus optischem Spezialglas und hat die Größe eines normalen Objektträgers für die Durchlichtmikroskopie, nämlich: 76 mm × 26 mm. In der Mitte der Grundfläche der Zählkammer befindet sich ein je nach Kammertyp unterschiedliches Liniennetz (Zählfläche, Zählnetz). Je nach Typ der auszuzählenden Teilchen wird eine bestimmte Anzahl Groß- oder Gruppenquadrate ausgezählt und daraus ein Mittelwert gebildet. Multipliziert man diesen Wert mit einem entsprechenden Faktor erhält man die Teilchenzahl pro Volumeneinheit. Die Bestimmung der Zellzahl in einer Zellkammer ist als manuelle Methode anfällig für Fehler durch z.B. Verdünnung, Volumen- und Pipettierfehler sowie die subjektive Definition und Bewertung einer Zelle. Die Vorbereitung und anschließende Reinigung der Zählkammer sind zeitaufwändig und häufig werden aus Zeitgründen nicht ausreichend viele Ereignisse ausgezählt.

Alle diese Anforderungen kann man natürlich mit einem einzigen entsprechend ausgestatteten Gerät adressieren (und es überrascht nicht, dass das Flaggschiff- Cellometer „Vision CBA“ auch all das bietet). Aber das ist natürlich wie immer im Leben auch eine Geldfrage, sodass für die meisten Labore je nach Anwendung auch die günstigen „Einsteigermodelle“ mit reiner Hellfeldoptik (i.d.R. für Zellkultur und eher homogene Proben) oder die mittleren Linien mit zusätzlicher Fluoreszenzoptik (für Primärproben) eine ausgezeichnete Wahl sind.

Zellen präzise, umfassend und reproduzierbar erfassen

Wichtig im Leben ist bekanntlich, was hinten rauskommt. Für Zellzählungen bedeutet das: wie präzise und reproduzierbar sind meine Messwerte? Und bekomme ich unabhängig vom Nutzer oder meiner Tagesform stets vergleichbare Werte? Zuallererst braucht es dafür aber eine hochwertige Optik und Beleuchtung, sowohl in den Hellfeld-, als auch in den Fluoreszenzvarianten. Bei letzteren sorgen separate Lichtquellen für die unterschiedlichen Kanäle für ein differenziertes Bild, und die Präzision z.B. in den Lebend-/Tot-Tests belohnt diesen instrumentellen Aufwand. Der wird übrigens auch bei der Erfassung des Sichtfeldes betrieben, denn die Cellometer scannen standardmäßig gleich mehrere Sichtfelder, um auch bei geringen Zellzahlen mit ordentlicher Statistik aufwarten zu können. Und das wirkt sich natürlich positiv auf den Messbereich aus.

Und dann kommen Nexceloms mit langer Erfahrung gereifte Algorithmen zur Zellerkennung ins Spiel. Nicht nur die verschiedenen Größen wollen erkannt und quantifiziert sein, auch unterschiedliche Morphologien sind zu berücksichtigen. Ganz besondere Herausforderungen bieten dabei immer wieder zusammengelagerte Zellen im Cluster, die vom Cellometer aber zuverlässig segmentiert und differenziert werden. Und nicht zuletzt gilt es, den berüchtigten „Schlunz“, also Verunreinigungen und Debris, zuverlässig auszuschließen. Alle Ergebnisse lassen sich übrigens nicht nur darstellen und drucken, sondern auch direkt im Netzwerk ablegen, wo auch die Bilder zur Dokumentation bei Bedarf auch immer wieder verfügbar sind.

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Minimale Probenvorbereitung, kleine Probenvolumina

Nicht nur was hinten rauskommt, auch was vorne reingeht spielt bei der Zellzählung eine große Rolle. Gerne darf es hier schnell und einfach zugehen: Die Probe wird auf einen entsprechenden Chip pipettiert, dieser dann ins Gerät eingeführt, die Messung gestartet und je nach Assay wird bereits nach wenigen Sekunden das Ergebnis dargestellt (s. Abb. 3). Diese Geschwindigkeit ist natürlich vor allem bei empfindlichen Zellen von Bedeutung, man denke beispielsweise an Hepatocyten. Bei Bedarf lässt sich die Erkennung oder z.B. der Ausschluss bestimmter Ereignisse übrigens auch nachträglich anpassen.

Alle Cellometer arbeiten einheitlich mit einem Probevolumen von nur 20 µl. Dabei ist die Handhabung mit diesem Standardvolumen immer gleich, was weitere Fehler vermeidet.

Keine Fluidikkomponenten, die verstopfen könnten

Zugute kommt den Ergebnissen und der Reproduzierbarkeit natürlich auch die Wartungsfreiheit der Systeme, die ohne Fluidikkomponenten eben auch nicht verstopfen können und morgens oder nach längerer Standzeit ohne weitere Vorbereitungen sofort einsatzbereit sind.

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LP-Tipp – Manuelle Zellzählung

Die klassische manuelle Methode der Zellzählung erfolgt in einer Zählkammer auch Hämozytometer genannt, weil sie oft zur Bestimmung der Anzahl von Blutzellen zum Einsatz kommt. Die Grundplatte der Zählkammer besteht aus optischem Spezialglas und hat die Größe eines normalen Objektträgers für die Durchlichtmikroskopie, nämlich: 76 mm × 26 mm. In der Mitte der Grundfläche der Zählkammer befindet sich ein je nach Kammertyp unterschiedliches Liniennetz (Zählfläche, Zählnetz). Je nach Typ der auszuzählenden Teilchen wird eine bestimmte Anzahl Groß- oder Gruppenquadrate ausgezählt und daraus ein Mittelwert gebildet. Multipliziert man diesen Wert mit einem entsprechenden Faktor erhält man die Teilchenzahl pro Volumeneinheit. Die Bestimmung der Zellzahl in einer Zellkammer ist als manuelle Methode anfällig für Fehler durch z.B. Verdünnung, Volumen- und Pipettierfehler sowie die subjektive Definition und Bewertung einer Zelle. Die Vorbereitung und anschließende Reinigung der Zählkammer sind zeitaufwändig und häufig werden aus Zeitgründen nicht ausreichend viele Ereignisse ausgezählt.

Und schließlich ist auch die Langzeitqualität im Dauereinsatz von Bedeutung. Auch im deutschen Sprachraum sind viele Cellometer schon seit etlichen Jahren im Einsatz, regelmäßige kostenlose Softwareupdates halten die Geräte stets aktuell und Ersatzteile und Reparaturmöglichkeiten sind auch nach langer Zeit gegeben, falls das doch einmal nötig sein sollte.

Mit dem hohen Qualitätsanspruch von Nexcelom und der resultierenden Präzision und Robustheit sind die Cellometer heute zum industriellen Standard geworden, um so mehr, wenn eine GLP-Zertifizierung gefordert ist. Entsprechende Dienstleistungen bietet der Distributor natürlich bei Bedarf mit an.

* Dr. C. Enz: Cenibra GmbH, 49565 Bramsche

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