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Einweg-Bioreaktor Zellkultivierung – gerührt, nicht geschüttelt

Autor / Redakteur: Stephanie Schweizer*, Yvonne Martin*, Claudia Schoeber* und Sven Wagner* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Zellkultivierung ist oftmals sehr zeitaufwändig und erfordert viel Medium. Lesen Sie, wie ein neuer Einweg-Bioreaktor zur Prozessverbesserung beitragen kann.

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1 Der Einweg-Bioreaktor SuperSpinner D1000 ermöglicht durch sein Membranbegasungssystem höhere Ausbeuten. (Bilder: Sartorius Stedim Biotech)
1 Der Einweg-Bioreaktor SuperSpinner D1000 ermöglicht durch sein Membranbegasungssystem höhere Ausbeuten. (Bilder: Sartorius Stedim Biotech)
( Archiv: Vogel Business Media )

Für die Zellkultivierung existieren im Laborbereich diverse Systeme. Die traditionellen T-Flaschen, erhältlich in einer großen Auswahl an Kultivierungsoberflächen und Beschichtungen, sind für unterschiedliche Volumina einsetzbar. Sind die Volumina eher gering, bieten sich Kultivierungsgefäße im Multiwellformat an. Bei Suspensionszellen kann auf Einheiten in Röhrchenform zurückgegriffen werden, die eine Schraubkappe zur Belüftung besitzen und in handelsüblichen (Schüttel-)Inkubatoren verwendet werden können. Für Zellkulturvolumina von 100 bis 500 ml stehen darüber hinaus Bioreaktoren zur Verfügung, in denen unter statischen Bedingungen kultiviert wird. Hier ist die Kultivierungseinheit z.B. durch eine semipermeable Membran in ein Medien- und Zellkompartiment geteilt. Auch der Einsatz von traditionellen Erlenmeyerkolben, Multilayer-Flaschen sowie einfache Rollerflaschen sind für diesen Volumenbereich geeignet.

Einweg-Bioreaktor als Alternative

Zur Kultivierung von Volumina von 500 ml bis 1 Liter bietet sich der EinwegBioreaktor Superspinner D1000 an. Dieser besteht aus Polycarbonat, wird gebrauchsfertig geliefert und bietet dem Anwender ein perfektes, abgeschlossenes Kultivierungssystem, welches in einen handelsüblichen Inkubator platziert werden kann. Der Superspinner D1000 von Sartorius Stedim Biotech wurde als eigenständiges und sofort einsatzbereites System für die besonders effiziente Kultivierung von Suspensionszellen ohne zusätzliches Equipment entwickelt, um – durch Vermeidung hoher Rotationsgeschwindigkeiten – unter scherarmen Bedingungen zu kultivieren. Hauptmerkmal dieses Einweg-Bioreaktors ist ein Membranbegasungssystem, das direkt mit einem Magnetrührer kombiniert ist. Aufgrund einer besonders schonenden Durchmischung und blasenfreien Begasung der Zellkultur verhindert das System die Schaumbildung nachhaltig. Für eine optimale Sauerstoffzufuhr sorgt eine Hohlfasermembran, die mehrfach um den Rührer gewickelt ist und dadurch eine enorme Vergrößerung der (aktiven) Begasungs-oberfläche erreicht. Dadurch ist eine das Zellwachstum limitierende Sauerstoffzufuhr ausgeschlossen, was sich – im Vergleich zu einer klassischen Spinner-Flasche – in einer hohen Produktivität widerspiegelt. Der Eintrag von Sauerstoff wird mit einer einfachen Membranpumpe gewährleistet, welche die Inkubatoratmosphäre über einen Sterilfilter in die Kultivierungsflasche befördert. Fungiert das Bio-Reaktorsystem als so genanntes Vorkulturgefäß, kann dieses durch einen Adapter direkt an einen größeren Bioreaktor, wie z.B. Biostat A plus, angeschlossen und die Zellen über Pumpen transferiert werden.

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Der Superspinner D1000 ist für eine Vielzahl von Suspensionszelllinien geeignet [1]. In Verbindung mit Mikro-Carriern kann das Einweg-Bioreaktorsystem jedoch auch für adhärente Zellen verwendet werden. Nachfolgend wird eine Kultivierung der beiden adhärenten Zelllinien CHO-K1 bzw. MC3T3 beschrieben, die mithilfe von Mikro-Carriern (Cytodex I) im Superspinner D1000 kultiviert wurden.

Die CHO-K1 Zellen wurden in Ham‘s F12 Medium mit 10% fetalem Kälberserum und 4 mM L-Glutamin bei 37 °C, 5%CO2 und 80% Feuchtigkeit kultiviert. Die embryonalen Mausfibroblastenzellen (MC3T3) wurden analog in alpha-Mem-Medium mit einem Zusatz von 10% fetalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin kultiviert. Die Spezifikationen der Cytodex I Mikro-Carrier sind in der Tabelle 1 zusammengefasst.

Für die Kultivierung wurden die CHO-K1-Zellen in einem Anfangsvolumen von 200 ml und mit einer Zellkonzentration von 1 x 105 Zellen/ml mit 0,4 g Cytodex I bei 37 °C inkubiert. Die Rotationsgeschwindigkeit des Magnetrührers betrug 35 rpm. Nach 48 Stunden und 96 Stunden wurde das Zellkulturvolumen auf 400 ml bzw. 800 ml erhöht und zusätzlich wurden weitere sterile Mikro-Carrier (0,2 bzw. 0,4 g) zugegeben. Das Startvolumen der MC3T3-Zellen betrug ebenfalls 200 ml, die Zellkonzentration lag bei 0,4 x 105 Zellen/ml mit 0,4 g Cytodex I Mikro-Carriern. In den ersten 96 Stunden wurde mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 35 rpm gerührt, anschließend auf 45 rpm erhöht. Das Volumen wurde auf 400 bzw. 800 ml nach 48 Stunden bzw. 96 Stunden erhöht, ebenso wie die Anzahl der Mikro-Carrier (0,2 g nach 48 Stunden und 0,4 g nach 96 Stunden). Nach 96 Stunden hatte sich die Zelldichte bei den CHO-K1 Zellen um das 19-fache von 1,97 x 107 auf 3,73 x 108 erhöht. Im Vergleich dazu konnte bei den MC3T3 sogar eine 25-fache Erhöhung der Zelldichte von 8,2 x 106 auf 2 x 108 nachgewiesen werden (s. Abb. 2). Vergleicht man die Gesamt-Zellzahl der kultivierten Zellen so konnte eine maximale Zelldichte für CHO-K1 von 6,6 x 108 nach 192 Stunden erreicht werden. Im Vergleich dazu wurde nach 240 Stunden eine Zellzahl von max. 8,0 x 108 Zellen bei MC3T3 erlangt (s. Abb. 3). Die Tabelle 2 zeigt einen theoretischen Vergleich der Zellkultivierung mittels Superspinner D1000 und jener mit traditionellen T-Flaschen. Bei einer Kultivierungsdauer von über acht Tagen werden mit dem Einwegbioreaktorsystem beispielweise maximale Zelldichten von 6,6 x 108 bis 8,02 x 108 erreicht. Um die identische Anzahl von Zellen zu generieren, werden 59 T-75-Flaschen bzw. 29 T-175-Flaschen benötigt. Neben einem dafür notwendigen, deutlich gesteigerten Platzbedarf, erhöht sich zusätzlich der Mediumbedarf um das dreifache.

Fazit

Für die Kultivierung im Labormaßstab sind wichtige Parameter, wie z.B. eine ausreichende Sauerstoffzufuhr und eine gute Durchmischung der Zellen für eine gesteigerte Zellausbeute essenziell. Diese Anforderungen werden vom Einweg-Bioreaktor Superspinner D1000, der sowohl für Suspensions- als auch adhärente Zelllinien bis zu einem Liter Zellkulturvolumen verwendbar ist, hervorragend erfüllt. Durch seinen Einsatz ist der Bedarf an Medium und Platz im Vergleich zu traditionellen T-Flaschen deutlich reduziert. Dies macht den Superspinner D1000 zu einem kosteneffizienten und praktischen Einweg-Bioreaktor im Labormaßstab.

Literatur

[1] Nature Methods – 5 (2008), Superspinner D1000: a disposable bioreactor for efficient lab-scale cultivation of animal cells

*S. Schweizer, Y. Martin, C. Schoeber, S. Wagner, Sartorius Stedim Biotech GmbH, 37079 Göttingen

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