Forelle malachitgrün

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Shimadzu Deutschland GmbH

Gerstel GmbH & Co. KG

SIM Scientific Instruments Manufacturer GmbH

Der Triphenylmethanfarbstoff Malachitgrün (MG) bekämpft wirksam Pilze, Bakterien und Einzeller. MG steht allerdings auch im Verdacht, das Erbgut zu verändern und Krebs auszulösen, gelangt der Wirkstoff über den Konsum kontaminierter Lebensmittel in den menschlichen Organismus. Traditionell wird Malachitgrün eingesetzt, um Aquakulturen vor Pilzinfektionen zu bewahren oder sie zu behandeln. Einmal im Fischorganismus angekommen, wird MG zu Leukomalachitgrün (LMG) reduziert und im Fettgewebe eingelagert. Fisch, der mit MG kontaminiert ist, sollte aufgrund des erheblichen Gesundheitsrisikos nicht verzehrt werden. 2003 hat die EU-Kommission zwei Mikrogramm pro Kilogramm als höchstzulässigen Grenzwert für MG und LMG festgesetzt. Dank einer neuen Methode gelingt es, beide Substanzen sensitiv und effizient nachzuweisen. Grundlage bildet ein LC/MS-Iontrap-System von Agilent in Kombination mit dem Multi-Purpose-Sampler (MPS) von Gerstel.??Probenvorbereitung??Eine Fischfiletprobe wird homogenisiert, mit einer Lösung von Acetonitril und Wasser extrahiert und zentrifugiert. Der flüssige Überstand wird entnommen und gesammelt. Dieser Extraktionsvorgang wird zweimal wiederholt. Die gesammelten Extrakte werden eingedampft und der Rückstand mit einer Mischung aus Methanol und Wasser aufgenommen. Die Aufreinigung der Probe erfolgt mittels Festphasenextraktion (SPE) automatisch in einem Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS).??Nachweis mit der LC/MS-Methode??Der MPS war integriert in ein Agilent 1100 LC/MS-Iontrap-System, bestehend aus Binärpumpe, thermostatisiertem Säulengehäuse, Dioden-Array-Detektor und einem XCT+-Iontrap-MS. Das LC/IT-MS wurde mit Elektronenspray-Ionisierung im Positiv-Ionen-Modus verwendet. Das für alle Analysen verwendete Injektionsvolumen betrug fünf Mikroliter. Die Trennungen erfolgten auf einer Zorbax SB-C18-Säule (50 x 2,1 mm, 1,8?µm) mit einer Flussrate von 0,6 Milliliter pro Minute im Gradientenmodus (Eluat A: 0,1 Prozent Ameisensäure, Eluat B: Acetonitril). Die Säule war auf 50?°C temperiert. Die vollständige Systemsteuerung, einschließlich Probenvorbereitung, LC/MS-Analyse und Datenbearbeitung, erfolgte mit der Gerstel-Maestro-Software, eingebunden in die Chemstation von Agilent Technologies (Rev. A10.03).??Ergebnis und Diskussion??Malachitgrün (MG) und sein Metabolit Leukomalachitgrün (LMG) lassen sich mittels Elektronensprayionisation (ESI) im Positiv-Ionen-Modus leicht ionisieren. Im Gegensatz zu MG bildet LMG ein doppelt geladenes Ion (m/z 166) zusätzlich zum einfach geladenen molekularen Ion [M-H]+ (Abb. 3). Das ist auf die nicht-planare ?sterische Struktur des zentralen Kohlenstoffs in der Leukoform zurückzuführen (Abb. 4). ??Im MS²-Modus der Ionenfalle bildet das MG-Vorläuferion ein Produkt (m/z 313), während der doppelt geladene LGM-Vorläufer ein Molekülfragment bildet, das auch doppelt geladen ist. Der Übergang ist hochsensitiv und lässt sich für die äußerst sensitive LMG-Analyse nutzen. Unter Verwendung beider Übergänge ließen sich Bestimmungsgrenzen von 0,5 Mikrogramm pro Kilogramm für MG und 0,05 Mikrogramm pro Kilogramm für LMG verwirklichen. ??Die automatisierte SPE in direkter Kopplung mit dem LC/MS-System garantiert hohe Wiederfindung, im äußersten Fall 90 Prozent, und eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitungsschritte. Zudem erfordert die automatisierte Probenvorbereitung nur etwa 50 Prozent der Zeit, die für die manuelle Vorgehensweise zu veranschlagen gewesen wäre. ??Fazit??Das beschriebene automatisierte SPE- und LC/IT-MS-System ermöglicht es, die Probe automatisiert aufzureinigen und das Extrakt direkt zu analysieren. Die Methode lässt sich leicht und den individuellen Erfordernissen entsprechend per Mausklick aus einem übersichtlichen Menü zusammenstellen und anschließend automatisch aus der Chemstation von Agilent Technologies heraus ausführen. Dank der Aufreinigung lassen sich störende Matrixbestandteile aus dem Extrakt entfernen. Dies führt zu einer erheblich besseren MS-Response und niedrigeren Detektionslimits. Die Methode ist robust und stabil (relative Standardabweichung 3,4 bis 5,3 Prozent) und garantiert eine gute Wiederfindung (89,5 bis 90,3 Prozent).

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