Vermeidung von Totvolumina

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Die chromatographische Auflösung zwischen benachbarten Peaks reicht nicht aus, um bei kritischen Paaren, speziell bei kurzen Retentionszeiten eine zufriedenstellende Trennung zu erreichen.? ? Was ist die Ursache, und wie kann man dies vermeiden?? ? Um eine akzeptable Trennung zu erhalten, sollte versucht werden, das Totvolumen zu minimieren. Unter Totvolumen versteht man in einer isokratischen Anlage das Volumen von der Injektion bis zur Detektorzelle ohne Betrachtung der Säule. Zur Bestimmung des Totvolumens kann man sich im ersten Ansatz auf den visuellen Eindruck der Trennung verlassen. Reicht die Trennung dem Anwender aus, ist ein zusätzlicher Aufwand zur weiteren Optimierung häufig nicht gerechtfertigt. Anders sieht es bei kritischen Trennungen oder früh eluierenden Substanzen aus. Hier macht es häufig Sinn, zunächst das Totvolumen zu bestimmen, um beurteilen zu können, ob an dieser Stelle optimiert werden sollte. Hierzu muss das Injektionsventil (ggf. der Autosamplerausgang) direkt mit der Detektorzelle verbunden werden und durch die Injektion einer UV-aktiven Substanz wie z.B. 1µl Aceton überprüft werden, welches Volumen wirklich vorliegt. Diese Substanz zeigt dann einen Peak, über dessen Retentionsvolumen direkt das Totvolumen bestimmt werden kann. Man kann mit etwa 50µl Totvolumen zufrieden sein, eine sehr gute Anlage sollte 20µl nicht überschreiten. Dabei ist folgendes zu beachten: hat eine Kapillare einen Innendurchmesser von 0,1 mm beträgt das Totvolumen 0,1µl pro cm Säulenlänge, steigt der Innendurchmesser auf 1mm liegt das Totvolumen bereits bei 8 µl pro cm Länge. Ein größeres Volumen vor der Injektion beeinflusst die Trennung nicht, sodass in der isokratischen HPLC auch ein voluminöser Pulsationsdämpfer verwendet werden kann. Allerdings ist im Bereich der Injektion, die möglichst punktförmig aufgegeben werden soll, eine Verdünnung der Probe unerwünscht. Der beschriebene Effekt tritt auf, da sich der Lösemittelanteil im Totvolumen mit dem injizierten Lösemittelanteil zu einem größeren Volumen aufsummiert, sodass schon am Säulenkopf eine größere Diffusion auftritt, welche die Trennschärfe negativ beeinflusst. ? ? Die optimale Lösung zur Vermeidung des Totvolumens ist eine direkte Kopplung der Säule an das Injektionsventil sowie an die Detektorzelle. Sicher ist es falsch, zwischen Säulenende und Detektor noch Manipulationen, z.B. In-line-Filter-Einbau vorzunehmen, da es dann zu Verwirbelungen und damit verbundenen Rückmischungen kommt. Außerdem sollte die Anlage in dem gesamten Bereich thermostatisiert werden, um ein Temperaturgefälle zwischen Injektor und Detektor zu vermeiden (s. HPLC Tipps & Tricks Nr. 3, LP 12/06).? +49 (0) 1 70 / 5 22 29 96? In der nächsten Ausgabe geht es um die Sicherheit der Peak-identifikation.

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