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LABORAUTOMATION Automatisierte Extraktion von DNA aus Pflanzen

Autor / Redakteur: JÜRGEN FETZER* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Mit Hilfe einer Automationslösung für die DNA-Extraktion bei Pflanzen soll die Qualität und Quantität der isolierten DNA verbessert werden, um für groß angelegte Pflanzengenotypisierungsprojekte - bzw, die Anwendung von Fungiziden - genauere Aussagen treffen zu können.

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( Archiv: Vogel Business Media )

Fungizide sind biologische oder chemische Präparate, die gegen pilzliche Krankheitserreger wirken, ohne die Kulturpflanze dabei zu schädigen. Das bessere Verständnis für den Einsatz von präventiven Fungiziden gehört zu den Forschungsgebieten in der Gruppe von Cesare Gessler am Institut für Pflanzenforschung des Swiss Federal Institute of Technology. Mit Hilfe einer Automationslösung für die DNA Extraktion bei Pflanzen soll die Qualität und Quantität der isolierten DNA verbessert werden, um für groß angelegte Pflanzengenotypisierungsprojekte genauere Aussagen treffen zu können.

Falscher Mehltau, der von dem Oomyceten Plasmopara viticola verursacht wird, ist eine der am weitest verbreiteten Krankheiten der Weinstöcke (Vitis vinifera). Sein sprunghaftes Auftreten und hohes Reproduktionspotential muss durch den Einsatz von präventiven Fungiziden kontrolliert werden. Eines der Forschungsbereiche in der Gruppe von Cesare Gessler, am Institut für Pflanzenforschung des Swiss Federal Institute of Technology in Zürich, ist das Verstehen der Mechanismen und die Entwicklung besserer Lösungen zur Eindämmung dieser problematischen Traubenkrankheit.

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Es wurden vier Microsatellitenmarker entwickelt um bisher unbekannte Aspekte der Epidemiologie und der genetischen Variabilität des Pathogens zu erforschen. Zu diesem Zweck wurde im Labor am Institut für Pflanzenforschung ein Hochdurchsatz-Isolationssystem für Pflanzen DNA eingerichtet. Die Automation dieser Methode spielt eine äußerst wichtige Rolle in vielen groß angelegten Pflanzen-Genotypisierungsprojekten, wie u.a. Populationsstudien, Pflanzenzucht und Untersuchungen an GVOs (genetisch veränderte Organismen).

Dennoch sind Durchsatz, Qualität und Quantität der DNA sehr oft die limitierenden Parameter der nachfolgenden genetischen Untersuchungen. Die Freedom EVO Nucleic Acid Sample Preparation Workstation von Tecan (Abb. 1) ist eine flexible Plattform für die vollautomatische DNA-Extraktion aus Pflanzen im 96-Well Format. Zusätzlich können durch die Verwendung einer passenden Ablageeinheit auch größere Chargen von 96-Well Platten ohne manuelle Arbeitsschritte verarbeitet werden.

Die Extraktion

Nach dem Homogenisieren der Pflanzen kann die DNA mit einem Lysispuffer, der denaturierende Agenzien und Detergenzien enthält, extrahiert werden. Die Lysislösung wird von verbleibenden Zelltrümmern mittels Zentrifugation befreit. Der klare Überstand wird mit einem Bindungspuffer, der chaotrope Salze und Ethanol enthält, vermischt, wodurch für die Bindung an die Silikamembran optimale Bedingungen geschaffen werden. Nach zwei Waschschritten mit verschiedenen Pufferlösungen kann die DNA in einer niedrig konzentrierten Salzlösung oder destilliertem Wasser eluiert werden und ist direkt für nachfolgende Versuche, wie PCR, RAPD (“Random Amplification of Polymorphic DNA“), AFLP (“Amplified Fragment-Length Polymorphism“) oder Southern Blot verwendbar.

Automation des Prozesses

Freedom EVO wurde für die Automatisierung der DNA Extraktion aus Pflanzen mit Kits, wie dem Macherey-Nagel Nucleo-Spin 96 Plant, entwickelt. Das Instrument ist mit acht Pipettierkanälen für Einwegspitzen und einem Roboterarm (“Robotic Manipulator Arm“, RoMa) bestückt. Das Gemini Software Paket steuert das gesamte System. Alle Schritte, die im Vakuum durchgeführt werden, benutzen das integrierte Te-VacS Modul. Der komplette Prozess ist in drei Schritte unterteilt:

- 30-minütige Lyse des Pflanzenmaterials im Inkubator- 20-minütige Zentrifugation- die Reinigung des Lysats (von Freedom EVO und Te-VacS durchgeführt), das bei 96 Proben 70 Minuten dauert. Insgesamt dauert die Verarbeitung von 96 Proben somit zwei Stunden.

Der Prozess im DetailDie Pflanzenblätter werden zuerst 12 Stunden gefriergetrocknet und, nach einer Gewichtsmessung, mit einem Rund-Well Block mit 3 mm Metalkügelchen in einem Retsch MM300 Homogenisator zermahlen. Dieser Schritt dauert 20 Sekunden bei 30 s-1. Die gemahlenen Proben werden zusammen mit den Reagenzien des NucleoSpin 96 Plant Kits auf die Arbeitsfläche der Freedom EVO geladen und der automatisierte Prozess wird gestartet. Das resultierende Elutionsvolumen ist 100 µl. Spezifische PCR der extrahierten Pflanzen DNA wurde mit einem Primerpaar für das TrnL Intron durchgeführt [1], wobei 1 bis 5 µl der extrahierten DNA als Template eingesetzt wurden. Parasiten-spezifische Amplifikation wurde mit dem SSR Marker CES getestet, der spezifisch für die DNA von Plasmopara viticola ist. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 3 zu sehen.

Aus gemahlenen und gefriergetrocknetem Pflanzenblättern verschiedener Pflanzenspezies konnte eine schnelle und verlässliche DNA Extraktion erzielt werden. Es wurden Proben zwischen 5 mg (für Amplifikation) und bis zu 75 mg (für eine präparative Extraktion) verarbeitet. Abhängig von der Art der Probe lag die Ausbeute zwischen 120 und 420 ng DNA pro mg gefriergetrocknetem Pflanzenmaterial. Die genauen und homogenen Ergebnisse der Amplifikationstests zeigten, dass die gereinigte DNA frei von PCR inhibierenden Kontaminationen ist (Abb. 2 und 3).

FazitDie Freedom EVO Nucleic Acid Sample Preparation Workstation garantiert zusammen mit dem NucleoSpin 96 Plant Kit eine zuverlässige DNA Extraktion aus Pflanzen mit mehreren Verbesserungen gegenüber herkömmlichen Verfahren:- Verarbeitung von 96 Proben in ca. 120 Minuten- Homogene Ausbeute von einer Vielzahl verschiedener Pflanzenspezies- Die extrahierte DNA ist sofort ohne weitere Arbeitsschritte für verschiedene Anwendungen einsetzbar, wie PCR oder Southern Blot und kundenspezifische Anwendungen, wie die Analyse coextrahierter DNA von Parasiten.

Diese Daten wurden freundlicherweise von G. Valsesia und D. Gobbin aus der Gruppe von Cesare Gessler am Institut für Pflanzenforschung, Swiss Federal Institute of Technology, Zürich, Schweiz zur Verfügung gestellt.*J. Fetzer, Tecan Deutschland, 74564 Crailsheim

Literatur:[1] Tabernet et al., Plant Mol Bio. 1991 (5): 1105-9

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