Suchen

MIKROBIOLOGIE

Automatisierte Generierung von Zelllinien

| Autor/ Redakteur: EVERARD PAP* UND SILKE GRÜNEBERG* / Gerd Kielburger

Zelllinien spielen eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung neuer Medikamente. Sie erlauben die (Über-) Expression von funktionellen Proteinen unter nativen Bedingungenm (GPCRs, Ionenkanäle, nukleare Rezeptoren).

Firmen zum Thema

Abb.1: Die Plattformen von Tecan mit ihrem offenen Konzept können mit verschiedensten Modulen zu einem vollautomatisierten System zur Zellliniengenerierung kombiniert werden.
Abb.1: Die Plattformen von Tecan mit ihrem offenen Konzept können mit verschiedensten Modulen zu einem vollautomatisierten System zur Zellliniengenerierung kombiniert werden.
( Archiv: Vogel Business Media )

Zelllinien spielen eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung neuer Medikamente. Sie erlauben die (Über-) Expression von funktionellen Proteinen unter nativen Bedingungenm (GPCRs, Ionenkanäle, nukleare Rezeptoren) und können als in vitro Modelle für Gewebe oder Organe fungieren. Dabei kann der Einfluss von Wirkstoffen oder neuen Substanzen auf lebende Zellen untersucht werden.

Die bei Zelllinien-Expressions-Experimenten gefundenen Ergebnisse ermöglichen eine Vorhersage von Interaktionen oder spezifischen Effekten auf das exprimierte Protein. Grundlage hierfür sind ausgefeilte Analysetechniken, wie kinetische Methoden oder Reporterassays, mit denen Veränderungen einer Zelle unter definierten experimentellen Bedingungen gemessen werden können. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur automatisierten Generierung von Zelllinien mit der Tecan Genesis Workstation, die den Anwender von nahezu allen sich ständig wiederholenden Arbeitsschritten entlastet.

Bildergalerie

Bildergalerie mit 6 Bildern

Transfektion der Zellen

Die Transfektion der Zellen wird nach dem Protokoll des Herstellers auf der Genesis Arbeitsplattform mit Hilfe des Liquid-Handling-Arms (LiHa) durchgeführt. Nach Transfektion und Selektion mit dem Antibiotikum werden die transfizierten Zellen verdünnt und je eine Zelle in die Platte pipettiert (Abb. 2).

Nach Wachstum der einzelnen Zellen zu Zellkolonien und nach Ablösen der Zellen mit Trypsin, stellt der Te-MO mehrere Kopien der Platten mit verschiedenen Zellzahlen her. Dazu wird das Medium zunächst vollständig entfernt und die Zellen einmal mit dem entsprechenden Volumen Phosphatpuffer (PBS) gewaschen.

Anschließend wird das Trypsin sofort zugegeben, die Zellen 2-5 Minuten inkubiert und frisches Medium zugegeben. Nach vorsichtigem Mischen erhält man Zellsuspensionen in den einzelnen Wells, die dann in die Tochterplatten transferiert werden können. Dabei können mehrere Kopien dieser Platten mit verschiedenen Volumina der Zellsuspension generiert werden, so dass man Platten mit unterschiedlicher Zelldichte erhält. Im letzten Schritt werden die Wells mit frischem Medium aufgefüllt und unter Standardbedingungen kultiviert.

Die Beobachtung der Zellen und die Identifizierung von Einzelzellkolonien erfolgt durch ein automatisiertes Mikroskop, das über einen Hochpräzisionsfokus und eine motorbetriebene Halterung für automatisierte Bildaufnahmen aller Wells einer 384-Well Platte verfügt. Die Bildverarbeitungssoftware berechnet die Zahl der Zellkolonien pro Well und deren Wachstumsrate und stellt sie in einer Liste dar (Abb. 3), die in eine Arbeitsliste für die Gemini Workstation konvertiert wird. Zellen bestimmter Wells werden gepickt und mit Hilfe des LiHa in eine Mutterplatte in einem definierten Well gesammelt. Das Ablösen der Zellen und die Resuspendierungsprozeduren werden wie vorher beschrieben durchgeführt.

Kultivierung der Zelllinien

Die Inkubation der Zellen erfolgt in 96- oder 384-Well Platten in einem Liconic StoreX 200 System bei 37ºC und einer Luftfeuchtigkeit von 95%. Nach drei Tagen wird das Medium nach folgendem Protokoll ausgetauscht: Der Roboterarm (RoMa) der Genesis Workstation platziert die Platte von der Sicherheitswerkbank StoreX in die Waschstation Te-MO 96. Das verbrauchte Medium wird komplett entfernt und frisches Medium sofort zugegeben, damit die Zellen nicht austrocknen. Das Medium kann ready-to-use mit allen Komponenten zur sofortigen Verwendung erworben oder durch Hinzufügen der Komponenten in der Workstation frisch hergestellt werden. Nicht verschlossene Medien und Platten müssen unter sterilen Bedingungen verarbeitet werden, daher sollte die komplette Plattform in einer sterilen Werkschutzbank installiert sein.

Ergebnisse

Mit dem LiHa kann unter Verwendung eines geeigneten Systems und mit den entsprechenden Protokollen die Transfektion automatisiert durchgeführt werden,wobei die Transfektionseffizienz vergleichbar hoch mit manuell durchgeführten Protokollen ist (Abb. 4).

Das voll automatische Mikroskop ist in der Lage, Zellkolonien zu identifizieren und eine Liste mit ihren entsprechenden Positionen in der 384-Well Platte zu erstellen. Diese Liste wird in eine Arbeitsliste für die Software Gemini/Facts konvertiert, die die Genesis Workstation 200/8 kontrolliert. Der LiHa pickt Kolonien wie in der Arbeitsliste angegeben und transferiert sie in neue Mutterplatten. Zur Kultivierung der Zellen wird das Medium alle drei Tage ausgetauscht (Abb. 5). Die Verwendung der Te-MO mit sterilen Pipettenspitzen (mit Filter) und einer langsamen Pipettiergeschwindigkeit erlaubt den Austausch des Mediums in 384-Well Platten in weniger als 60 Sekunden. Der Te-Stack mit bis zu 12 Racks versorgt das System mit neuen Pipettenspitzen (Abb. 6). Je nach den experimentellen Erfordernissen können weitere neue Tochterplatten generiert werden.

Diskussion

Aufgrund der kommerziell verfügbaren und validierten Transfektionsmethoden gehört die Generierung von stabilen Zelllinien zu einer standardmäßig durchgeführten Methode. Die Laborautomation führt zu einer enormen Vereinfachung dieser Technik und erlaubt die Generierung einer großen Zahl an Zellklonen, die mit den gleichen Protokollen und unter gleichen Bedingungen erhalten worden sind.

Die hier beschriebene Anwendung stellt einen Weg zur automatisierten Zellliniengenerierung dar - dabei können die Transfektion, die Selektion mit Antibiotika und die weitere Kultivierung der Zellen in der Tecan Workstation vollautomatisiert durchgeführt werden. Aufgrund des offenen Konzepts der automatisierten Tecan Plattform können die Te-Stacks und das Te-MO System mit verschiedensten Systemen zur Reagenzienlagerung und -versorgung zu einem automatisierten Zellliniengenerationssystem kombiniert werden (Abb. 6). Das so etablierte automatisierte Verfahren befreit den Anwender von ständig sich wiederholenden Arbeitsschritten und reduziert die effektive Arbeitszeit im Vergleich zur manuellen Verarbeitung um 50 bis 60 Prozent.

MATERIAL UND METHODEN

- Instrumente: Tecan Genesis Workstation 200/8 mit Te-MO 96: 500 µl Spritzen, Standardpipettenspitzen, Waschstation mit schneller Waschpumpe, Te-MO 96 (Abb. 6); Te-Stack für Te-MO mit Einwegspitzen; Sterile Sicherheitswerkbank Liconic StoreX 200 Automatisierter Inkubator; Mikroskop mit automatischem Hochpräzisionsfokus und einer automatisch bewegbaren Halterung zum Transport der Platte.- Chemikalien und Reagenzien: Transfektionsreagenzien, Fugene 6 Transfektionssystem (Roche)- Zellen: Hamster oder humane Zellen

*Dr. E. Pap und Dr. S. Grüneberg, Aventis Pharma Deutschland GmbH, LG High Throughput Screening, Frankfurt am Main

Dieser Beitrag ist urheberrechtlich geschützt. Sie wollen ihn für Ihre Zwecke verwenden? Kontaktieren Sie uns über: support.vogel.de (ID: 133064)

Über den Autor

Gerd Kielburger

Gerd Kielburger

Chefredakteur PROCESS