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LEBENSMITTELANALYTIK

Bestimmung von Chlortetracyclin in Schlachtproben

| Autor/ Redakteur: ANDREA VOCKEL*, MANFRED GROTE, ARMIN MEHLICH** / Gerd Kielburger

CTC bildet weitere, toxikologisch u.U. relevante Umwandlungs- und Abbauprodukte, wie Isochlortetracyclin und Anhydrochlortetracyclin, die ebenfalls epimerisieren können. Sind diese Produkte auch zuverlässig analytisch erfassbar – und sollten sie bei der Festlegung von MRL-Werten (Maximum Residue Limit) mit berücksichtigt werden?

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Abb.1: Strukturen und Symbole relevanter Umwandlungs- und Abbauprodukte des Chlortetracyclins.
Abb.1: Strukturen und Symbole relevanter Umwandlungs- und Abbauprodukte des Chlortetracyclins.
( Archiv: Vogel Business Media )

Rückstände von Chlortetracyclin (CTC) in Lebensmitteln tierischen Ursprungs sind gemäß gesetzlicher Vorschriften als Summe der Gehalte an CTC und des Epimeren e-CTC zu ermitteln. CTC bildet aber weitere, toxikologisch u.U. relevante Umwandlungs- und Abbauprodukte, wie Isochlortetracyclin und Anhydrochlortetracyclin, die ebenfalls epimerisieren können. Sind diese Produkte auch zuverlässig analytisch erfassbar – und sollten sie bei der Festlegung von MRL-Werten (Maximum Residue Limit) mit berücksichtigt werden?

Clortetracyclin (CTC) ist ein Antibiotikum, das häufig in der Schweinemast eingesetzt wird. CTC wird den Tieren meist oral über das Futter verabreicht. Die verbreitete Anwendung von Antibiotika ist jedoch mit steigendem Risiko der Resistenzentwicklung verbunden. Dabei wird die Entstehung und Verbreitung von Resistenzen heutzutage zunehmend in einem mikrobiell-ökologischen Zusammenhang zwischen Mensch, Tier, Pflanze und Umwelt gesehen.

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Im Rahmen von Rückstandskontrolluntersuchungen tierischer Produkte werden gemäß der EU-Verordnung EWG Nr. 2377/90 Chlortetracyclingehalte als Summe der Gehalte von CTC- und seinem Epimeren e-CTC bestimmt, da CTC in Lösung mit e-CTC in einem dynamischen Gleichgewicht steht. Vollständig validierte HPLC-Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tetracyclinen, welche auch Umwandlungs- und Abbauprodukte (s. Abb. 1) umfassen - vereinfachend „Metabolite“ genannt - liegen bislang nicht vor.

Ein Grund liegt sicherlich im Mangel an kommerziell erhältlichen Referenzsubstanzen, wie z.B. e-iso-CTC. Außerdem wurden diese Metabolite bislang als unbedenklich für den Verbraucher eingestuft. Erst in neuerer Zeit findet neben der antibiotischen Aktivität auch die Toxizität und die resistenzfördernde Wirkung dieser Verbindungen Beachtung. Zur Aufklärung der noch ungeklärten Rückstandsproblematik wurden zwei Medikationsstudien unter kontrollierten Bedingungen durchgeführt.

Es sollte sowohl das Ausscheidungsverhalten von CTC anhand von Kot- und Urinproben untersucht als auch die verbleibenden Rückstände in Schlachtproben analysiert werden.

HPLC-UV-MS/MS-Verfahren

Es wurden HPLC-UV-MS/MS-Verfahren entwickelt und validiert, wobei ein besonderes Augenmerk den möglichen Metaboliten von CTC galt. Zur chromatographischen Bestimmung von CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mit HPLC-UV-MS/MS (Alliance 2690 und PDA 996, Waters; Quattro Ultima, Micromass) erwies sich die YMC-ODS-AM-Trennsäule, basierend auf einem C 18-Material mit einem sehr geringen Metallionen-Gehalt, als optimal. Zur Trennung dieser Verbindungen mit einer guten symmetrischen Peakform ist ein Ameisensäure/Acetonitril-Gradient geeignet. Zur Identifizierung der Substanzen wurden Retentionszeiten, UV-Maxima und die mittels ESI-Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie erhaltenen Fragmentierungsmuster der einzelnen Verbindungen herangezogen. Die MS/MS-Detektion wurde im MRM-Modus und die Quantifizierung über den Totalionenstrom (TIC) der aufgenommenen Massenspuren durchgeführt (s. Abb. 2).

Die Quantifizierung von CTC und e-CTC kann in Muskulatur, Plasma, Faeces und Knochen sowohl mit UV- als auch MS/MS-Detektion erfolgen; für Urin, Leber und Niere ist sie aufgrund mangelnder Selektivität nur mit MS/MS-Detektion möglich. Zur Probenvorbereitung von Urin, Faeces, Plasma, Muskulatur, Leber, Niere und Knochen wurde ein Verfahren entwickelt, welches nach Extraktion der Probe mit McIlvain-Puffer eine Aufreinigung mittels Festphasenextraktion umfasst.

Validierung des Analysenverfahrens

Als SPE-Sorbentien wurden die Materialien Chromabond Tetracycline, Nexus und Oasis HLB erprobt. Dabei erwies sich die Oasis HLB-Kartusche zur Extraktion von CTC und e-CTC mit einem benötigten Elutionsvolumen von 2 mL als optimal (Tab. 1 und Abb. 3). Auch die anderen quantifizierten CTC-Metabolite werden auf diesem Sorbens mit zufrieden stellender Wiederfindung angereichert (Abb. 4).

Eine zweimalige Extraktion (Ultra-Turrax) der Proben mit McIlvain-Puffer reicht aus, um etwa 90 Prozent der Analyten zu extrahieren (Tab. 2). Dabei wird der Epimerisierungsgrad durch das schwach saure Milieu deutlich erhöht. Die umfassende Validierung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens erfolgte nach den gültigen Normen und Richtlinien der DIN EN ISO/IEC 17025, der FDA sowie der EU-Richtlinie 2002/ 657/EG.

Es wurden die Validierungsparameter Linearität, Selektivität, Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Richtigkeit und Präzision bestimmt. Die Bestimmungsgrenzen für die Bestimmung von CTC und e-CTC mit der MS/MS-Detektion liegen in Urin und Plasma bei 0,3 µg/L, in Leber und Niere bei 0,5 µg/kg, in Faeces bei 140 µg/kg und in Knochen bei 5 µg/kg. Für Muskulatur konnten Bestimmungsgrenzen von 8 µg/kg (UV-Detektion) und 0,3 µg/kg (MS/MS-Detektion) erzielt werden.

Für die Bestimmung von CTC und e-CTC mit UV-Detektion ist die Kalibrierfunktion in einem größeren Konzentrationsbereich (0,1 mg/L bis 100 mg/L) linear als die der MS/MS-Detektion, die eine Aufteilung des Arbeitsbereiches von 0,005 bis 50 mg/L in drei linear funktionalisierte Teilbereiche erfordert.

Die Selektivität des Verfahrens wurde durch einen Vergleich der Retentionszeiten, UV-Spektren, MS-Spektren und Produkt-Ionen-Intensitäten sowie durch eine für CTC und e-CTC charakteristische Peaklöschung bestätigt. Die Bestimmung der Richtigkeit erfolgte über die Ermittlung der Wiederfindung, die aus der Wiederfindungsfunktion berechnet wurde. Die Wiederfindungen wurden in Abhängigkeit von der Matrix zwischen 36 Prozent und 107 Prozent ermittelt (Abb. 3). Sie lagen damit teilweise unterhalb des akzeptierten Bereiches von 70 Prozent und 110 Prozent, können aber dennoch als akzeptabel betrachtet werden, da eine ausreichende Reproduzierbarkeit gegeben ist.

Die Messpräzision für die Bestimmung von CTC und e-CTC in Muskulatur mit der MS/MS-Detektion betrug durchschnittlich 5 Prozent und ist damit deutlich geringer als die geforderten 20 Prozent. Die Methodenpräzision unter Wiederholbedingungen lag mit Werten von 6 bis 8 Prozent für Muskulatur, Urin, Plasma, Faeces, Leber und Niere nur geringfügig oberhalb der für Muskulatur ermittelten Messpräzision. Für Knochen wurde aufgrund der Schwierigkeit, homogenes Probenmaterial zu gewinnen, eine höhere Methodenpräzision von 19 Prozent ermittelt. Das für die verschiedenen Matrizes entwickelte und validierte Verfahren wurde in Medikationsstudien angewendet.

Neben CTC wurden in allen Proben vor allem iso-CTC und e-CTC (Abb. 2) sowie in Faeces und Knochen auch geringfügige Mengen Anhydro-CTC und dessen Epimer nachgewiesen. Ein zusätzlich in den Proben aufgetretenes Produkt wurde anhand der UV- und Massenspektren - unterstützt von Literaturdaten - als keto-e-CTC mit cis- oder trans-Konfiguration identifiziert. Damit wurde erstmals die Möglichkeit einer massenspektrometrischen Unterscheidung der Keto-Enol-Tautomere anhand typischer Fragmentierungsreaktionen bzw. charakteristischer Produkt-Ionen aufgezeigt [10].

Berücksichtigung weiterer Metabolite?

Die vielfältigen Reaktionen des CTC können sowohl im lebenden Tier (in-vivo) als auch während der Analyse (in-vitro) stattfinden, so dass die Fragestellung, welche Stoffe in der Matrix tierischen Ursprungs tatsächlich vorhanden sind, nicht ohne weiteres beantwortet werden kann. Für die rechtliche Beurteilung ist diese Frage aber von großer Relevanz.

Angenommen, in einer gewachsenen Matrix würden ausschließlich CTC und e-CTC vorliegen und erst während der Analyse weitere Produkte entstehen, so wären sämtliche Produktkonzentrationen summarisch als Gesamtgehalt zu erfassen, ausgedrückt als „CTC“. Es gilt als wahrscheinlich, dass e-CTC, iso-CTC und e-iso-CTC in allen Matrizes sowohl in-vivo als auch in-vitro gebildet werden. Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC waren nur in Faeces und Knochen nachweisbar. In Knochen wird eine in-vitro-Bildung während des salzsauren Aufschlusses begünstigt, in Faeces dominieren in vivo-Bedingungen die Metabolitenbildung.

Ausgenommen iso-CTC, sind alle übrigen Verbindungen antibiotisch aktiv. Zur quantitativen Bestimmung der Metabolite iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC wurde das für CTC und e-CTC validierte Analysenverfahren entsprechend modifiziert.

Von methodischer Bedeutung ist dabei, dass das kommerziell nicht erhältliche e-iso-CTC durch Epimerisierung von iso-CTC in schwach saurer Standardlösung hergestellt und quantifiziert werden kann. Mit der erweiterten HPLC-UV-MS/MS-Methode wird dadurch eine simultane quantitative Bestimmung der genannten CTC-Komponenten möglich. Ergebnisse einer Bilanzierungsstudie, bei der die CTC-Total-Gehalte als Summe der CTC- und e-CTC-Gehalte in Schlachtproben (nach Ablauf der gesetzlich vorgeschriebenen 14-tägigen Wartezeit) ermittelt wurden, verdeutlichen, dass sich diese Gehalte unter Einbeziehung von iso-CTC und e-iso-CTC erheblich erhöhen.

Vor allem für Muskulatur konnte eine prozentuale Erhöhung um 77 Prozent festgestellt werden. Die Summengehalte lagen aber noch unterhalb der MRL-Werte. Es ist zu vermuten, dass es bei Rückstandskontrollen unter Einbeziehung dieser Metabolite häufiger zur Überschreitung der MRL-Werte kommen kann. Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC waren nur in Knochen nachweisbar und spielen mit prozentualen Anteilen von ca. 0,1 Prozent des CTC-Gesamt-Gehaltes nur eine untergeordnete Rolle.

Fazit

Die durchgeführten Untersuchungen belegen, dass auch bei bestimmungsgemäßer Anwendung von CTC bei Schweinen Rückstände in den aus diesen Tieren erzeugten Lebensmitteln unvermeidbar sind. Die den Schweinen applizierten Wirkstoffe können als ursprünglicher Wirkstoff oder als Metabolit mit antibiotisch wirksamer, resistenzfördernder oder toxischer Wirkung in die Nahrungskette und die Umwelt gelangen.

Die Ermittlung von Chlortetracyclin-Rückständen sollte daher nicht nur auf die Summe von CTC und e-CTC beschränkt bleiben, sondern auch relevante Metabolite mit einbeziehen. Die methodischen Voraussetzungen wurden dafür geschaffen.

HINTERGRUND:Antibiotika – Einsatz in der Tierzucht

Antibiotika gehören zu den bedeutendsten und am häufigsten eingesetzten human- und veterinärmedizinischen Therapeutika [4]. In der Europäischen Union stehen derzeit etwa 650 Wirksubstanzen zur Anwendung auf Lebensmittel liefernde Tiere zur Verfügung [5]. In der landwirtschaftlichen Tierhaltung finden Antibiotika zum einen zu therapeutischen, also medizinischen Zwecken, zum anderen aber auch zur Leistungsförderung Anwendung. Der therapeutische Einsatz von Antibiotika erfolgt bei landwirtschaftlichen Nutztieren aufgrund der Haltungsbedingungen in Form von „Massenbehandlungen“ bestandsweise über ganze Lebensabschnitte hinweg.

Dabei werden die Medikamente über das Futter oder Trinkwasser verabreicht. Leistungsförderer sind im Sinne des Futtermittelgesetzes keine Arzneimittel, sondern „Werkstoffe der Tierernährung“, die oral wirksam sind und bei Nutztieren zu einer Steigerung der Wachstumsrate und der Futterverwertung führen. Die auch als Futterzusatzstoffe bezeichneten Leistungsförderer fallen damit auch nicht unter die Bestimmungen des Arzneimittelgesetzes [6], obwohl sie eine pharmakologische Wirkung aufweisen können. Zur mastleistungssteigernden Wirkung werden auch therapeutisch wichtige Antibiotika, entgegen ihrer Zweckbestimmung in niedriger, subtherapeutischer Dosis verfüttert.

* Universität Paderborn, Department Chemie, 33098 Paderborn** Staatliches Veterinäruntersuchungsamt (SVUA), 32758 Detmold

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