Differenzielle Genexpression bei Stoffwechselerkrankungen

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Differenzielle Expression Lipid-assoziierter Gene

Zunächst isolierten die Forscher die gesamte RNA aus den Zellen und schrieben diese mithilfe der MMLV Reversen Transkriptase in cDNA um. Diese cDNA-Proben verwendeten sie sowohl für die Analyse mit Lipidomic Taqman Array Cards (Applied Biosystems, s. Abb. 2) als auch mit Lipidomic Taqman Array Plates (ebenfalls Applied Biosystems). Mit Taqman Array Cards können 384 Proben gleichzeitig analysiert werden. Lediglich eine geringe Menge des Mastermixes und der entsprechenden Probe müssen zu den vorpipettierten Primern und Sonden hinzugefügt werden. Bei der Taqman Array Plate handelt es sich um eine 96-Well-Platte. In jedem Reaktionsgefäß befindet sich ein spezifischer, getrockneter Taqman Assay. Das Reaktionsvolumen ist etwas größer als das der Taqman Array Card. Dafür eignet sich die Plate – im Gegensatz zur Card – für die Verwendung in allen Real-Time-PCR-Geräten mit einem 96-Well-Block.

Alle 48 Gene wurden zunächst auf der Lipidomic Taqman Array Plate getestet. Mit der SDS-Software v2.3 von Applied Biosystems konnte die Forschungsgruppe die Analysen vollautomatisch durchführen. Die Ergebnisse aus den Lipidomic Taqman Array Cards wurden mit Taqman Array Cards reproduziert und bestätigt. Für beide Versuchsreihen verwendete das Wissenschaftlerteam das 7900 HT Fast-Real-Time-PCR-System unter Standard-Temperatureinstellungen. Die Messdaten wurden mit der Software Relative Quantification (RQ) Manager v1.2 von Applied Biosystems ausgewertet. Die relativen Genexpressionswerte aus den sechs Taqman Array Cards ermittelten die Wissenschaftler mithilfe der komparativen Ct-Methode zur relativen Quantifizierung. Als Kalibrator für die einzelnen Stimulationen wählten sie cDNA von unstimulierten Zellen. Das stabilste Referenzgen GAPDH diente als endogene Kontrolle. Auf der Basis der errechneten relativen Expressionsraten ließen sich die Durchschnitts-RQ-Werte mithilfe der RQ-Software in einem 3-D-Balkendiagramm darstellen (s. Abb. 3). Zur weiteren Normalisierung und statistischen Auswertung der Daten nutzten die Forscher das Software-Paket Intergromics Realtime Statminer von Applied Biosystems.

Ergebnisse der Expressions-Profilierung Lipid-assoziierter Gene

Die Messungen zeigten, dass die Stimulation aller drei Zelltypen mit T0901317 und 9-cis RA einen induktiven Effekt auf mehrere Gene des Lipid-Stoffwechsels hatte. Außerdem reprimierten die entzündungsfördernden Stimuli LPS und Inf-gamma die meisten Lipid-assoziierten Gene, mit Ausnahme von Cox2, stark. Eine gleichzeitige Inkubation mit DHA schwächte den reprimierenden Effekt von LPS ab. Die Daten ergaben auch, dass Makrophagen aus dem Knochenmark ein sehr dynamisches, Lipid-assoziiertes Transkriptom aufweisen, wohingegen die Genexpression in primären Mikroglia und in der Mikroglia Zelllinie BV-2 auf einem niedrigeren Niveau reguliert wird [1]. Die Auswertung der Taqman Array Cards mit dem Integromics-Real-Time-Stat-Miner-Paket wurde anhand der relativen Quantifizierung von LPS + IFNgamma-stimulierten versus nicht-stimulierten Makrophagen gezeigt. Bei insgesamt 21 Genen war der regulatorische Effekt statistisch signifikant (s. Abb. 4, unten). Die Mehrzahl der übrigen Gene (s. Abb. 4, oben) zeigten ebenfalls eine Tendenz zur Herabregulation [1]. Das Ergebnis der Software Intergromics Realtime Statminer bestätigt somit die Analyse mit dem SDS-RQ-Manager.

Vergleich der beiden verwendeten Taqman-Systeme

Die Messwerte aus den Lipidomic Taqman Array Cards konnten in einer unabhängigen Versuchsreihe mit Taqman Array Plates reproduziert und bestätigt werden. Beide Techniken eignen sich somit gleichermaßen für die quantitative Hochdurchsatz-Transkriptomanalyse der wichtigsten Lipid-assoziierten Gene in Phagozyten und anderen Zellen. Zusammen mit der Realtime-Statminer-Software können mit diesen Analysesystemen statistisch ausgewertete Daten von hoher Qualität erzeugt werden.

Literatur:

[1] Walczak Y, Ebert S, Kaschkoetoe J, Schild T, Ferlinz A, Goni R, Langmann T: Expression Profiling of Microglia and Macrophages Using a Novel Lipidomic Taqman Array and Taqman Express Plates. BioTechniques, Vol. 46, No. 4, April 2009, pp. 432-434.

*T. Schild, A. Ferlinz, Applied Biosystems Deutschland GmbH, 64293 Darmstadt, **T. Langmann, Institut für Humangenetik, Universität Regensburg, 93053 Regensburg

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