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Gerstel GmbH & Co. KG

Redaktionsbüro Guido Deußing

Axel Semrau GmbH /Trajan Scientific and Medical

SIM Scientific Instruments Manufacturer GmbH

Analytische Bestimmung von Dopingmitteln

Obwohl Urin lange als die „bevorzugte Matrix für den Nachweis von Peptiden mit niederer Molmasse in Routinekontrollen“ galt, zeichnet sich ein Wandel in der Dopinganalytik ab. Inzwischen finden führende Dopinglaboratorien Gefallen an der Untersuchung trockener Blutstropfen (Dried Blood Spots, DBS). Diese Form der Proben hat sich inzwischen als attraktive Alternative in der Dopingkontrolle etabliert. Aus gutem Grund: Sie ist minimalinvasiv – ein Stich in die Fingerbeere genügt, um an hinreichende Probemengen zu kommen –, kosteneffizient und stabil in Bezug auf die Vielzahl der fokussierten Analyten, schreiben Lange et al. Zudem lassen sich nicht alle mit Doping in Verbindung stehende Wirkstoffe intakt, soll heißen, nur verstoffwechselt in Urin finden, wie das Beispiel GHRP-1 zeige.

Allerdings stelle das begrenzte Probenvolumen von 10 bis 20 µL Blut sowie dessen hochkomplexe Matrix (zerstörte [hämolysierte] Blutzellen sowie lösliche und unlösliche Proteine) Dopinglaboratorien in puncto Probenvorbereitung und Analytik vor eine Herausforderung. Die „Verwendung moderner chromatographisch-massenspektrometrischer Instrumente, vorzugsweise in Kombination mit einem automatisierten DBS-Probenvorbereitungsworkflow bietet sich an“, schreiben Lange et al., um „physiologisch relevante Konzentrationsniveaus der genannten Verbindungen ohne eine arbeits- und zeit­intensive manuelle Probenvorbereitung und Anreicherung der Analyten zu bestimmen“.

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Hintergrund zur automatisierten DBS-A

Wie die Praxis sowie auch die Methode von Lange et al. zeigt, erweist sich die DBS-Analyse als einfache Technik für die Untersuchung von Blut. Wenige Mikroliter davon genügen zur Durchführung einer DBS-Analyse [4]. Appliziert, bevorratet und zur Vermessung gelangt das Blut auf speziellen Cellulose-Karten, die als Probenträger fungieren. Die Effizienz und Produktivität der DBS-Analyse hängt jedoch signifikant von ihrem Automatisierungsgrad ab.

Eine leistungsfähige Gesamtlösung (DBS-A) auf Basis des Multi-Purpose-Samplers (MPS), gekoppelt an ein LC-MS/MS-System oder als Workstation, hat der in Mülheim an der Ruhr ansässige, international tätige Gerätehersteller Gerstel in Kooperation mit dem niederländischen Unternehmen Spark Holland entwickelt und erfolgreich im Labor­umfeld etabliert.

Die Funktionsweise des DBS-Probenhandlings lässt sich vereinfacht wie folgt erklären: Die Karte mit der getrockneten Blutprobe wird ins Rack des MPS gestellt. Der Autosampler transportiert sie zu einer Kamera; eine integrierte Bilderkennungssoftware bestimmt die Lage und bewertet die Qualität des getrockneten Blutstropfens. Anschließend wird die Karte ins Desorptionsinterface bewegt, in dem eine definierte Fläche des Blutstropfens (2 bis 8 mm Durchmesser) von einem Lösungsmittel durchströmt wird, um die Analyten zu desorbieren (Flow Through Desorption, FTD). Interne Standards lassen sich hinzu dosieren, Aufreinigungsschritte auf einer automatisch auswechselbaren SPE-Kartusche anschließen. Nach dem Transfer der Analyten in das HPLC-System oder dem Sammeln von Extrakten unter Einsatz der MPS-Workstation – einschließlich weiterer automatisierter Probenvorbereitungsschritte wie Eindampfen und Derivatisieren – wird die DBS-Karte freigegeben und die Leitungen werden gespült.

Zu Dokumentationszwecken wird noch ein Foto der Karte nach dem Desorptionsschritt angefertigt. Insofern das Gesamtsystem direkt an die HPLC gekoppelt ist, werden die Analyten aus dem desorbierten Bereich vollständig auf die HPLC-Säule und damit ins Massenspektrometer überführt, was für sehr gute Nachweisgrenzen sorgt. „Das DBS-A-Gesamtsystem lässt sich allerdings nicht nur für Blutproben nutzen, die Analyse einer Vielzahl anderer flüssiger Matrices wie Plasma, Urin oder Wasser ist sinnvoll und möglich“, berichtet Dr. Oliver Lerch, Applikationsexperte von Gerstel.

Effiziente und sichere Dopingkontrolle

Wie Lange et al. zusammenfassen, steige die Nachfrage nach einem höheren Probendurchsatz an Sportdrogentests kontinuierlich an. Die DBS-Probensammlung könne dieser Entwicklung Rechnung tragen, sind die Wissenschaftler der Sporthochschule Köln überzeugt. Mit ihrem vollautomatisierten DBS-LC/HRMS-System analysierten Lange et al. im Rahmen ihrer Methodenentwicklung 46 niedermolekulare Peptid- oder Nichtpeptid- (mimetische) Zielanalyten sowie Glycin-modifizierte Analoga. GHRP-1 – bislang im Urin nur mittels diagnostischer Abbauprodukte nachgewiesen – ließ sich in der DBS-Analyse intakt detektieren, erstmals auch Felypressin, ein ADH-Rezeptoragonist.

Trotz des geringen DBS-Volumens von nur 10 bis 20 µl habe man größte Empfindlichkeiten erreicht: „Bemerkenswerterweise konnten mehr als 60 Prozent der Analyten unterhalb der von der WADA geforderten Mindestleistungsgrenze (MRPL) von 2 ng/ml für Urin nachgewiesen werden“, schreiben Lange und Kollegen. Bisher sei keine MRPL-Spezifikation für Serum respektive Plasma oder DBS verfügbar. Darüber hinaus sei mit einem der DBS-Analyse vorgeschalteten NIR-Verfahren die zerstörungsfreie Messung des Hämatokritwertes (Hct; gibt Auskunft über die Fließfähigkeit des Blutes) implementiert und die Robustheit des Assays hinsichtlich der Extrahierbarkeit für verschiedene Hct-Werte demonstriert. Dieser Ansatz könnte zu einer Hct-abhängigen Korrektur beitragen und würde in Zukunft quantitative DBS-Anwendungen unterstützen, berichten die Forscher.

In puncto Effizienz ihrer Methode berichten Lange et al., dass es ihnen gelungen sei, sechs Proben in zwei Stunden zu analysieren. Da Probenvorbereitung und LC/HRMS-Analyse ungefähr gleich lang dauerten, bestehe die Möglichkeit, die Probenvorbereitung parallel zur Analyse der vorherigen Probe in einem „Just-in-Time-Workflow“ durchzuführen. Allein die Automatisierung sowie die programmierbare Verschachtelung der Vorbereitungsschritte innerhalb der Sequenz führten gegenüber jeder ausgeklügelten manuellen Vorgehensweise zu einem höheren Probendurchsatz.

Hinsichtlich der weiteren Perspektiven berichten Lange et al. von einer einfachen Ausweitung ihrer DBS-A-LC/HRMS-System-basierten Methode auf weitere Dopingstoffe. Zudem zeichne sich derzeit auch die Anwendung der DBS-A-Analytik in Bezug auf den Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern ab [5].

Quellen:

[1] Tobias Lange, Andreas Thomas, Katja Walpurgis und Mario Thevis, Fully automated dried blood spot sample preparation enables the detection of lower molecular mass peptide and non-peptide doping agents by means of LC-HRMS, Analytical and Bioanalytical Chemistry (2019), https://doi.org/10.1007/s00216-020-02634-4

[2] Deutsche Sporthochschule Köln, Institut für Biochemie, „GHRP - GHRPs (growth hormone releasing peptides)“, https://bit.ly/2XZGmbu

[3] NADA, Verbotsliste 2020, https://bit.ly/376QiE0

[4] Guido Deußing, Was ein Blutstropfen verrät, Laborpraxis 11 (2015) 20-22, https://bit.ly/375fpaE

[5] Thevis et al., Can dried blood spots (DBS) contribute to conducting comprehensive SARS‐CoV‐2 antibody tests?, Drug Testing and Analysis (2020), https://doi.org/10.1002/dta.2816

* G. Deußing: Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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