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Lyophilisation

Gefriertrocknung im Labormaßstab

| Autor/ Redakteur: Dr. Induka Abeysena* und Rob Darrington* / Marc Platthaus

Aggressive organische Lösungsmittel oder eine große Anzahl von Proben können Schwierigkeiten bei der Gefriertrocknung mit sich bringen. Die Kombination von Rotationsverdampfer und Lypophilisation erleichtert das Handling und kann auch für die Vorbereitung vieler Proben z.B. für die spätere Untersuchung in der NMR-Spektroskopie eingesetzt werden.

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Seit vielen Jahren wird die Lyophilisation (Gefriertrocknung) zur Trocknung von Proben im Labor eingesetzt. Die Technik ist in vielen Laboratorien etabliert und für Forscher, die nur wenige Proben trocknen müssen, ist die Lyophilisation die Methode der Wahl. Ihre Vorteile sind neben dem erreichten Trockenheitsgrad bzw. geringere Restmengen an Lösungsmitteln auch der leichte, pulvrige und lockere Zustand der Proben, der die Entnahme und das Auswiegen der Proben erleichtert.

Konventionelle Gefriertrockner können allerdings wie nachfolgend aufgeführt auch eine Reihe von Nachteilen mit sich bringen:

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  • Für die Vorbereitung der Proben steht nur eine begrenzte Anzahl von Lösungsmitteln zur Verfügung und oft kann nur Wasser verwendet werden.
  • Flüchtige organische Lösungsmittel und deren Gemische können nicht eingesetzt werden.
  • Das Verfahren ist in der Regel zeitaufwändig.

Aus diesem Grund werden für die Bearbeitung einer hohen Anzahl von Proben, z.B. von präparativen Reverse-Phase-HPLC-Trennungen auf der Basis von Wasser und Acetonitril, oft Rotationsverdampfer eingesetzt. In anderen Laboren, z.B. beim Compound-Handling, verbieten die aggressiven Eigenschaften von organischen Lösungsmitteln die Verwendung von Gefriertrocknern. Unter diesen Bedingungen sind selbst hochentwickelte Rotationsverdampfer wie das Modell Genevac HT-4X (s. Abb.1) von begrenztem Nutzen. Proben trocknen als Film und die anschließende Resuspendierung kann unter Umständen schwierig sein; bei manchen Proben bleibt Lösungsmittel zurück und einige Proben können aufgrund ihrer Zusammensetzung gar nicht getrocknet werden.

In diesem Beitrag werden die Ergebnisse einer Studie vorgestellt, die zur Entwicklung einer Kombinationslösung führen sollte. Ziel war es, ein schnelles Paralleltrocknen der Proben und einen hohen Trocknungsgrad zu erreichen. Darüber hinaus wurde die oft gewünschte lockere Probenkonsistenz nach der Trocknung und eine zuverlässige Trocknung aller Proben angestrebt.

Probleme bei der Reinigung

Die von Reinigungslabors bearbeiteten Proben sind typischerweise in einem Wasser-/Acetonitrilgemisch mit einem niedrig konzentrierten Zusatz eines Modifiers, normalerweise 0,1 Prozent TFA (Trifluoressigsäure), gelöst. Das Entfernen dieses Lösungsmittelgemisches mit einem Gefriertrockner ist mit vielen Schwierigkeiten verbunden. Durch seinen niedrigen Gefrierpunkt (-65 °C) gefriert Acetonitril nur bei sehr niedrigem Vakuum oder aber es muss ein Gefriertrockner verwendet werden, der die Trocknung bei Tiefsttemperaturen ermöglicht. Wird das Acetonitril nicht eingefroren, können das Aufkochen von Lösungsmittel und damit Probenverluste und Kreuzkontaminationen nicht vermieden werden. Darüber hinaus verhindert in Eis eingeschlossenes Acetonitril den Aufbau eines guten Vakuums. Damit ist die Lyophilisation von Wasser fast unmöglich und das Verfahren darüber hinaus sehr zeitaufwändig.

Aus diesen Gründen wird gewöhnlich die Rotationsverdampfung eingesetzt, bei der viele Proben parallel getrocknet werden können. Auch das Aufkochen von Lösungsmitteln beim Trocknen von Gemischen kann so vermieden werden.

Trotzdem ist auch diese Methode mit zwei potenziellen Problemen behaftet, die beide mit Probeneffekten zu tun haben. Benutzer berichten von Problemen beim Trocknen nur weniger Proben pro Lauf. Dabei kommt es vor, dass die TFA nicht vollständig entfernt wird und verbleibende TFA die Proben bei der Lagerung beschädigt. Außerdem könnte sie den Siedepunkt des Wassers erhöhen und die Trocknung erschweren. Darüber hinaus zeigen NMR-Analysen Restlösungsmittel an. Obwohl diese Probleme nur gelegentlich auftreten, ist das manuelle Auffinden solcher „Fehlproben“ für viele automatisierte Labors unmöglich.

Einsatz eines Rotationsverdampfers

Wässrige Proben können nur in Rotationsverdampfern lyophilisiert werden, in denen das bestmögliche Vakuum verwendet wird. Das Genevac HT-4X, ausgestattet mit einer lösungsmittelresistenten Scroll-Pumpe, kann ein Vakuum unter 0,5 mbar erreichen, das für das Gefrieren von Wasser mehr als ausreichend ist. Dieses Verfahren entspricht aber der normalen Gefriertrocknung und ist daher zeitaufwändig.

Vor einigen Jahren entwickelte Genevac ein Verfahren, mit dem sich zunächst mit dem Rotationsverdampfer der größte Teil des Lösungsmittel schnell bis auf wenige Milliliter entfernen ließ. Anschließend konnte auf einen Gefriertrocknungsbetriebsmodus umgeschaltet werden. Auf diese Weise wurden beide Methoden miteinander kombiniert. Bei einem Genevac-Kunden konnte die Verfahrensdauer für 96 30-ml-Fraktionen so von 48 Stunden in einem Gefriertrockner auf 16 Stunden (über Nacht) in einem Genevac HT-12 verkürzt werden. Die Trocknung einer 30-ml-Probe dauerte bei diesem sequenziellen Verfahren nur noch jeweils 10 Minuten. Auf dieser Grundlage wurde getestet, ob der Vorgang durch Aufwärmung der Proben während der Lyophilisation noch weiter beschleunigt werden kann.

Die Studie bestand aus zwei Teilen. Zunächst wurden die optimalen Bedingungen für das Lösungsmittel Wasser ermittelt. Dann wurde eine Wasser-Acetonitril-Gemisch verwendet, das für HPLC-Proben typisch ist.

Lyophilisation von Wasser

In allen Versuchen diente Ibuprofen-Natriumsalz als Standardprobe. 15 ml einer 0,01 M Stammlösung in Wasser wurden in 48 20-ml-Szintillationsfläschchen (Wheaton) gefüllt und bei unterschiedlichen Bedingungen in einem Rotationsverdampfer des Modells Genevac HT-4X lyophilisiert. In Abbildung 2 ist ein typischer Fläschchenhalter abgebildet.

Das Diagramm in Abbildung 3 zeigt die Temperatur- und Druckwerte bei der Wassergefriertrocknung aufgetragen gegen die Zeit. Diese Werte dienten der Aufstellung einer Basislinie. Die verwendeten Systemeinstellungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Trocknung der Proben dauerte etwa acht Stunden.

Obwohl in Abbildung 3 drei Phasen dargestellt werden, besteht die tatsächliche Evaporationsmethode aus bis zu vier Phasen:

  • Konzentration des größten Lösungsmittelanteils mit schneller Verdampfung,
  • Kühlen der Proben und Probenhalter in Vorbereitung des nächsten Schrittes,
  • Gefrieren der Proben mit einem niedrigen Vakuum,
  • Lyophilisation des verbleibenden Lösungsmittels mit oder ohne erhöhte Temperaturen.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Methodenentwicklung für die Verarbeitung von wässrigen Proben. Bei den aufeinanderfolgenden Läufen wurden steigende Temperaturen verwendet. So konnte gezeigt werden, dass die Gesamtverfahrensdauer von acht Stunden in Versuch 1 auf 5,5 Stunden in Versuch 4 vermindert werden konnte. In Abbildung 4 werden die Ergebnisse des Versuchs 4 dargestellt.

Da die genaue Verarbeitungsdauer für die jeweiligen Versuchsbedingungen nicht bekannt waren, wurden die Proben zu lange bearbeitet und dann auf der Grundlage der Daten der vorher erreichte Endpunkt bestimmt. Um die Bestimmung des Endpunktes einheitlich durchzuführen, wurde dieser als der Zeitpunkt definiert, bei dem die Probentemperatur positiv wurde. Zu diesem Zeitpunkt wärmen sich die Proben schnell auf, da der Kühlungseffekt durch die Lyophilisation nicht länger vorhanden ist.

Zu den besten Laborpraktiken gehörte nach Meinung der Experten eine Abkühlphase (Phase 2). Diese hatte in der Vergangenheit gut funktioniert, ist aber nie getestet worden. Tatsächlich werden die Proben auch durch die Gefrierphase abgekühlt, und wie Versuch 5 zeigt, ist eine separate Abkühlphase nicht notwendig. Hingegen ist die Gefrierphase ohne Aufwärmung wie in Versuch 6 gezeigt unabdingbar. In diesem Fall trockneten die Proben auf normale Weise und wurden nicht lyophilisiert. Die Daten wiesen da-rauf hin, dass die Proben zu keinem Zeitpunkt gefroren waren. Die Ergebnisse des Versuchs 3 sind vermutlich Ausreißer.

Lyophilisation von Wasser/Acetonitril

Natürlich sind die in dieser Studie erreichten Zeiteinsparungen willkommen, doch ist die Gefriertrocknung von Wasser für die allermeisten Benutzer von untergeordneter Bedeutung. Die wichtigere Frage ist die nach der Handhabung von Lösungsmittelgemischen. Die Methode, die für Wasser benutzt wird, wurde daher modifiziert und eine frühere Phase, Phase 0, zur Entfernung des Acetonitrils eingeführt.

Die Phase 0 besteht aus drei Unterphasen:

  • Dri-Pure – Vakuumrampen und hohe Rotorgeschwindigkeiten zur Vermeidung des Aufkochens;
  • Konzentration – eine 40-mbar-Phase zur Entfernung des Acetonitrils ohne Gefrieren des Wassers (Bei 40 mbar siedet Acetonitril bei +2°C);
  • Entleerung der Kühlfalle – verbleibendes Acetonitril stört den Aufbau eines Vakuums in späteren Phasen und muss daher entfernt werden.

Für diese Versuche wurde eine 0,01 M-Stammlösung aus Ibuprofen-Natriumsalz und einer Wasser/Acetonitril-Mischung (60:40) hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Wie die Daten zeigen, werden die Optimalbedingungen erst bei Versuch 10 erreicht. Genau wie bei der Wasserentfernung war keine Abkühlphase notwendig. Das Verfahren musste mit Blick auf ein ausgewogenes Verhältnis von Konzentration und Lyophilisation etwas angepasst werden. 48 15-ml-Proben trockneten in fünf Stunden im Vergleich zu 6,25 Stunden bei sequenzieller Trocknung. In Abbildung 5 a und b wird der Unterschied zwischen einer lyophilisierten Probe (Versuch 10) und einer traditionell rotationsverdampften Probe (Versuche 7, 8, 9 und 11) dargestellt. Die lyophilisierte Probe kann zudem viel leichter resuspendiert werden, als die getrockneten Proben. Letztere lösen sich nach der Trocknung nicht ganz auf.

Schlussfolgerungen und Diskussion

Eine Lyophilisation der Proben erleichtert das anschließende Aufnehmen und Resuspendieren der getrockneten Probe. Mittels Lyophilisation bei höheren Temperaturen konnte die Lyophilisationsdauer erheblich verkürzt werden. Für die Etablierung einer Lyophilisationsmethode ist eine traditionelle Abkühlmethode nicht notwendig. Hingegen ist auf der anderen Seite die Gefrierphase unerlässlich. Bei der Evaporation eines Wasser-/Acetonitrilgemisches ist es notwendig, nach Evaporation des Acetonitrils und vor Evaporation und Lyophilisation des Wassers die Kühlfalle zu leeren. Verbleibendes Acetonitril beeinträchtigt den Aufbau des Vakuums und die ordnungsgemäßen Lyophilisationsbedingungen können nicht erreicht werden.

Die Kühlfalle des Systems HT-4X musste bei Ende der Phase 0 von Hand geleert werden. Bei einigen Systemen von Genevac kann dies bereits automatisiert werden, sodass während des Verfahrens kein Eingreifen des Benutzers notwendig ist. Auf Grundlage dieser Studie werden zur Zeit automatische Kühlfallenentleerfunktionen für die Genevac-Modelle HT-4X und HT-12 entwickelt.

*Dr. I. Abeysena* und R. Darrington, Genevac Ltd., IP1 5AP Ipswich/Großbritannien

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