Antioxidantien Gesamteinfluss von Antioxidantien bestimmen

Es ist äußerst selten, dass nur eine oxidative Substanz in Produkten verarbeitet ist oder natürlich vorkommt. Durch gegenseitige Beeinflussung kann es zu Synergieeffekten kommen. Das System Photochem kann auf Basis der Photochemolumineszenz die anti-oxidative Gesamtkapazität eines Produktes bestimmen.

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Analytik Jena AG

Sie werden als Radikalfänger, Oxidationshemmer oder als Antioxidantien bezeichnet und sind derzeit buchstäblich in aller Munde. Durch die Aufnahme von Antioxidantien mit der Nahrung sollen Auswirkungen des sogenannten oxidativen Stresses vermindert werden können. Ob sie – wie von den Nahrungsmittelproduzenten behauptet – vor Schädigungen von z.B. Zellkernen und -membranen schützen und somit Krankheiten wie Arteriosklerose, Krebs und Grauen Star positiv beeinflussen, ist allerdings umstritten. Doch sie sind wegen ihrer konservierenden und schützenden Eigenschaften auch für Produkte von Interesse. Daher ist ihre Bestimmung für Hersteller von Nahrungsmitteln und Getränken sehr wichtig.

Gerade Naturprodukte enthalten eine Vielzahl verschiedener antioxidativ wirkendender Substanzen wie Vitamine, Flavanoide oder Selen. Viele dieser chemisch unterschiedlichen Substanzen kommen gemeinsam vor und reagieren auf- bzw. miteinander, es kommt also zu Synergieeffekten. Dies bedeutet auch, dass die Wirkung einer Kombination sowohl um ein vielfaches größer als auch kleiner als die Summe der Einzelwirkungen sein kann. Daher wird nicht die einzelne antioxidativ wirkende Substanz bestimmt, sondern ihre Summe als sogenannte antioxidative Kapazität. Analytik Jena hat ein Gerät zur Messung von Antioxidantien auf Basis der Photochemolumineszenz entwickelt. Mit dem Photochem ist die schnelle Kontrolle der totalen antioxidativen Kapazität von Stoffgemischen, wie sie nicht nur in Nahrungsmitteln sondern auch in Blutplasma, Kosmetika oder Pharmazeutika vorkommen, möglich.

Das System umfasst das Gerät Photochem zur Messung der Photochemolumineszenz und darauf abgestimmte, standardisierte Testkits für Proben mit unterschiedlichem Löslichkeitsverhalten und für verschiedene spezielle Anwendungen. Durch die Methode der Photochemolumineszenz (PCL) wird die schnelle photochemische Anregung der Radikalbildung mit dem empfindlichen chemoluminometrischen Nachweis kombiniert. Die Vorteile liegen einerseits in der Verringerung der Analysezeiten auf wenige Minuten für eine Messung und andererseits in den sehr hohen Empfindlichkeiten im Bereich nanomolarer Konzentrationen nicht-enzymatischer antioxidativer Substanzen. Das Wirkprinzip der PCL-Methode beruht auf der vielfachen Beschleunigung einer natürlichen Reaktion, die zur Bildung eines Superoxidanionenradikals führt. Dies wird durch optische Anregung einer photosensitiven Substanz und der nachfolgenden Bildung des Messradikals erreicht. Die freien Radikale können anschließend mit chemoluminogenen Substanzen nachgewiesen werden. Damit wird eine drastisch verkürzte Messzeit für die Bestimmung der integralen antioxidativen Kapazität erreicht. Während der Messung wird die Messlösung mit dem Photosensitizer und der Messlösung mit UV-Licht bestrahlt (Photoinduktion) und anschließend in eine Messzelle überführt, in der die Chemolumineszenz gemessen wird.

Das Photochem ermittelt abhängig von der verwendeten Kit-Vorschrift entweder die totale lipid- (ACL) oder totale wasserlösliche (ACW) antioxidative Kapazität der Probe. Für das Photochem existieren eine ganze Reihe von Anwendungsmöglichkeiten für die Bestimmung der antioxidativen Kapazität, wie zum Beispiel in Lebensmitteln, wie Bier, Wein, Käse, Kaffee, Mehl, Tee, Salami, getrockneten Früchten, Pflanzenextrakten, frischem Gemüse und Obst, Speiseölen oder Kindernahrung. Als Beispiele werden hier Applikationen für Ölproben, Hefeproben und Pflanzenextrakte vorgestellt.

Es wurden verschiedene tierische und pflanzliche Öle auf ihre antioxidative Kapazität untersucht. Für diese Untersuchung wurden 100 Mikroliter Ölprobe aufgenommen. Abhängig von der Probe wurden weitere Verdünnungen durchgeführt. Pro Messung wurden zehn Mikroliter der verdünnten Probenlösung in das Testkit eingesetzt und mittels Photochem gemessen. Die Durchführung der Kalibration und der Messungen erfolgte gemäß den entsprechenden ACL-Vorschriften [1]. Die entsprechenden Messkurven sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Angabe der Resultate erfolgt bei lipidlöslichen Substanzen in Troloxäquivalenten (Referenz: Vitamin E-Derivat Trolox; Ergebnisse s. Tab. 1).

Die untersuchten Proben lassen sich mit dem Photochem sehr gut unterscheiden, das Fischöl hat die höchste antioxidative Kapazität und MCT die geringste.

Weiterhin wurden verschiedene Proben von Walnussöl untersucht. Da es sich bei den untersuchten Walnussölen um Naturprodukte handelt, muss berücksichtigt werden, dass diese aufgrund ihrer unterschiedlichen Herkunft, Verarbeitung und Lagerung keine einheitliche antioxidative Kapazität aufweisen. Das gilt auch für die anderen genannten Öle. Die antioxidative Kapazität liegt zwischen 400 bis 700 µg/ml (s. Abb. 3).

Stabilität von Hefekulturen bestimmen

Es wurden einige Hefeproben untersucht, um den Einfluss verschiedener Zusätze auf die Stabilität der Hefekulturen zu untersuchen. Bestimmt werden sollten die wasserlösliche und lipidlösliche antioxidative Kapazität in verschiedenen Hefeproben mit Zusätzen. Hierbei waren die Probe 1 ohne Zusatz, Probe 1V enthielt einen Vitamin-Zusatz und den Proben 2 bis 5 wurden verschiedene Antioxidantien zugesetzt, um die Kulturen zu stabilisieren.

Für die Messung wurden 50 Milligramm Hefekultur in einem Milliliter destilliertem Wasser suspendiert und abfiltriert. Danach wurde die Filterflüssigkeit aufgenommen und 15 Minuten stehen gelassen, danach zwei Minuten bei 8000 rpm zentrifugiert. Das Messvolumen betrug 50 Mikroliter vom Überstand. Für die ACL-Messung wurden die Proben statt in Wasser in einem Milliliter Methanol gelöst. Die Durchführung der Kalibration und der Messungen erfolgte gemäß den entsprechenden ACL- und ACW-Vorschriften [1-2]. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Sie zeigen den signifikanten Anstieg an Troloxäquivalenten in der Probe 1V mit zugesetztem Vitamin. Das bedeutet, dass die Stabilität der Hefekulturen erhöht wird. Die Proben 2 bis 5 enthielten andere antioxidative Substanzen. Ihre Wirkung erreicht nicht die Wirkung des Vitaminzusatzes, für Probe 5 wurde sogar ein niedrigerer Wert festgestellt. Das zeigt, dass das Zusammenwirken unterschiedlicher antioxidativer Substanzen auch einen gegenteiligen Effekt auf die antioxidative Kapazität eines Stoffsystems haben kann.

Unterschiedliche Verteilung in Pflanzenextrakten

Auch Pflanzenextrakte können mit dieser einfachen und empfindlichen Methode vermessen werden. Für die Messung wurden extern vorbereitete Proben verwendet. Abhängig vom Pflanzenextrakt wurden zehn bis 50 Mikroliter entnommen und zur Messung eingesetzt. Die wasserlösliche und lipidlösliche antioxidative Kapazität in den verschiedenen Pflanzenextrakten wird in Abbildung 4 dargestellt.

Die Vermessung der Pflanzenextrakte zeigt die unterschiedliche Verteilung der Antioxidantien in den wässrigen und fettlöslichen Fraktionen. Für die meisten Pflanzenextrakte lässt sich eine stärkere antioxidative Kapazität entweder in der einen oder der anderen Fraktion bestimmen. Daher kann eine gezielte Auswahl für eine industrielle Anwendung getroffen werden. Es ist jedoch zu beachten, dass eine Mischung der Pflanzenextrakte bei gemeinsamen Einsatz sowohl zu Verstärkungs- als auch zu Abschwächungseffekten bei der antioxidativen Kapazität führen kann. Daher ist dabei eine Neubestimmung der antioxidativen Kapazität notwendig.

Antioxidative Zusätze in Nahrungsmitteln, die der Verlängerung der Haltbarkeit und dem Erhalt der Qualität dienen, können synthetischen oder natürlichen Ursprungs sein. Da synthetisch hergestellte Lebensmittelzusätze vom Verbraucher oft kritisch beurteilt werden, besteht seitens der Industrie starkes Interesse an der Verwendung von Zusätzen natürlicher Herkunft. Da viele Pflanzen antioxidativ wirksame Substanzen enthalten, ist es möglich, solche Zusätze aus Pflanzenextrakten zu gewinnen. Pflanzenextrakte weisen jedoch infolge verschiedener Einflussfaktoren starke Schwankungen des Wirkstoffgehaltes auf. Solche Einflussfaktoren sind z.B. das Anbaugebiet und unterschiedliche jahreszeitliche Wetterbedingungen, der Erntezeitpunkt aber auch Herstellungsbedingungen wie Extraktionsverfahren, Lagerung und Transport. Probleme für die Verwendbarkeit einzelner Extrakte in verschiedenen Nahrungsmitteln ergeben sich weiterhin aus unterschiedlichen Löslichkeiten einzelner Inhaltsstoffe und dem oft starken Eigengeschmack von Pflanzenextrakten. Aufgabe der Hersteller ist es daher, den Wirkstoffgehalt sowohl der Ausgangskomponenten als auch des Endproduktes zu messen, um ein normiertes Produkt mit standardisiertem Wirkstoffgehalt anbieten zu können.

Basierend auf dem Photochemolumineszenzverfahren erlaubt das Photochem eine aussagekräftige Bestimmung der antioxidativen Kapazität in komplexen Substanzgemischen. Mit dem System können sowohl fettlösliche als auch wasserlösliche Antioxidantien in der Regel ohne aufwändige Probenvorbereitung innerhalb weniger Minuten gemessen werden. Da aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Methode die Probenmenge im gesamten Messansatz nur einen geringen Teil ausmacht und das Messsystem eine Reihe verschiedener Lösungsmittel toleriert, können auch in anderen Lösungsmitteln gelöste Proben meist ohne größere Probleme gemessen werden. Hohe Genauigkeit, sehr kurze Messzeiten und einfache Handhabung kennzeichnen das Messverfahren. Damit erfüllt es die Anforderungen, die an ein routinetaugliches System gestellt werden. Die Kombination des Photochem-Gerätes und standardisierter Testkits ermöglicht die zeit- und kosteneffektive Analytik von Antioxidantien in vielen Anwendungsgebieten.

Literatur

[1] Protokoll für die Bestimmung der antioxidativen Kapazität von lipidlöslichen Stoffen mit dem Gerät Photochem, Analytik Jena

[2] Protokoll für die Bestimmung der antioxidativen Kapazität von wasserlöslichen Stoffen mit dem Gerät Photochem, Analytik Jena

*Dr. B. Özmen, Analytik Jena AG, 07745 Jena

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