Giftkräuter in Lebens- und Futtermitteln analytisch im Griff

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Redaktionsbüro Guido Deußing

Das BfR empfiehlt für die Bestimmung von PA in Pflanzenmaterial eine LC-MS/MS-Methode nach vorangegangener Anreicherung der Analyten mittels Festphasenextraktion (SPE) [5]: Die PA werden aus dem Pflanzenmaterial mit schwefelsaurem Wasser unter Verwendung eines Ultraschallbads zweifach extrahiert. Anschließend werden die Proben zentrifugiert und ein Aliquot des Überstands wird zur Festphasenextraktion (SPE) unter Verwendung von C-18-Materialien eingesetzt. Nach methanolischer Elution der PA, wird das Eluat bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand wird in einem Methanol-Wasser-Gemisch (HPLC-Anfangsbedingungen) aufgenommen. Im Anschluss erfolgen die chromatographische Trennung und die Detektion mittels Massenspektrometrie [1].

Ein Auftragslabor, das sich auf die Analyse von Lebens- und Futtermitteln spezialisiert hat, ist auf eine effiziente Bearbeitung der Proben angewiesen. „Hierin liegt das große Manko der BfR-Methode, nämlich der hohe Arbeits- und Zeitaufwand insbesondere für die Probenvorbereitung“, sagt Franziska Chmelka, diplomierte Lebensmitteltechnologin und Geschäftsführerin von Tela, eines akkreditierten, auf die Analyse von Lebensmitteln und Umweltproben spezialisierten Auftragslabors. Um die Produktivität bei der Analytik zu steigern, hat die Tela die BfR-Methode kurzerhand automatisiert.

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Fokus auf die eingesetzte Analysentechnik

Für die PA-Analyse nutzen Franziska Chmelka und Kollegen eine Gerätekombination bestehend aus einem Multi-Purpose-Sampler (Gerstel-MPS) insbesondere für die automatisierte SPE in Verbindung mit einem LC-MS/MS-System von Agilent Technologies (1290er HPLC+ 6495 Triple Quadrupol). Die Trennung der Analyten erfolgt auf einer Standard-RP-Phase (Nucleodur C18 HTec 250 x 2 mm x 5 µm, Macherey-Nagel), unter Verwendung eines Eluentengradienten bestehend aus 5 mM Ameisensäure (Eluent A) und Methanol (Eluent B): 0 min (5% B) – 3 min (5% B) – 7 min (20% B) – 13 min (20% B) – 16 min (65% B) – 17 min (95% B) – 20,1 min (5% B). Die Flussrate beträgt 0,25 mL/min, die Säulentemperatur 28 °C. Injiziert werden 5 µL des Eluats. Die Analyten werden im Multiple Reaction Monitoring (MRM, ESI positiv) gezielt detektiert. Für die Methodenentwicklung verwenden sie eine wässrige Standardlösung, die 17 verschiedene, in der BfR-Methode genannte PA enthält: Monocrotalin, Erucifolin, Intermedin, Jacobin, Lycopsamin, Monocrotalin-N-oxid, Erucifolin-N-Oxid, Intermedin-N-Oxid, Retrorsin, Jacobin-N-Oxid, Senecivernin, Senecionin, Retrorsin-N-oxid, Senecivernin-N-Oxid, Senecionin-N-oxid, Lasiocarpin und Lasiocarpin-N-oxid.

Die automatisierte SPE als Schlüssel

„Unser Augenmerk bei der Methodenentwicklung lag auf der Automatisierung des zeit- und arbeitsintensivsten Arbeitsschritts, sprich der Festphasenextraktion (SPE)“, berichtet Franziska Chmelka. Nach der erforderlichen Experimentierphase legten sich die Applikationsexperten der Tela auf ein geeignetes C18-RP-Material als Sorbens fest (Macherey-Nagel C18 ec 3 mL/500 mg). Sämtliche SPE-Schritte ließen sich im Zuge ihrer Methodenentwicklung erfolgreich automatisieren: die Konditionierung des Sorbens mit 5 mL Methanol und 5 mL Wasser, die Aufgabe von 5 mL Probe auf das Sorbens sowie die Elution der Analyten mit 5 mL Methanol. „Es ist uns ebenfalls gelungen, berichtet Dr. Norbert Helle, geschäftsführender Gesellschafter und ausgewiesener LC/MS-Experte, „das Eindampfen des Eluats, die Wiederaufnahme des Rückstands mit 1 mL 10-prozentigem Methanol sowie die Injektion von 5 µL des resultierenden Extrakts in das LC-MS/MS-System zu automatisieren“.

Die Analyse der Standardmischung habe ein in jeder Hinsicht sauberes Chromatogramm mit gut aufgelösten Signalen ergeben. Franziska Chmelka: „Eine gute Trennung und Auflösung der einzelnen Substanzen ist äußerst wichtig, weil viele sehr ähnliche Massenübergänge besitzen und somit eine Differenzierung der verschiedenen PA nur über Retentionszeiten möglich ist.“

Anschließend stellten die Applikationsexperten der Tela die Funktionstauglichkeit von Geräten und Methode auf den Prüfstand, indem sie reale Proben, sprich die Blätter von Jakobs-Greiskraut, analysierten. Hierbei habe sich gezeigt, „sämtliche statistisch relevanten Parameter überzeugten von der Güte unserer automatisierten SPE-LC-MS/MS-Methode“, berichtet Franziska Chmelka und weiter: „Die Linerarität war über einen weiten Kalibrationsbereich bis runter auf 1 ng/mL hervorragend. Gleiches gilt für die Wiederfindung, die von Analyt zu Analyt zwischen 85 und 98 Prozent variierte. Die Reproduzierbarkeit der Methode, einschließlich Probenvorbereitung und Messung, zeigte eine analytabhängige Schwankungsbreite zwischen 1,29 und 4,83 Prozent. Besonders wichtig war, dass die Retentionszeiten stabil waren und lediglich zwischen 0,063 und 0,35 Prozent über einen Messzeitraum von mehreren Tagen schwankten. Bestimmunggrenzen zwischen 0,5 bis 0,05 µg/kg sind erreichbar.“

In einem weiteren Arbeitsschritt gingen sie der Frage nach, wie viele PA tatsächlich in den Tee übergehen. Zu diesem Zweck versetzte sie Kamillentee mit unterschiedlichen Mengen Jakobs-Greiskraut, dessen Anteil betrug 10, 1 und 0,1 Gewichtsprozent gegenüber dem Kamillentee. Über das Resultat der Messung sagt Franziska Chmelka: „Bereits eine Dreingabe von 0,1 Prozent genüge, um PA im Tee nachzuweisen.“

Quellen:

[1] www.bfr.bund.de/cm/343/fragen-und-antworten-zu-pyrrolizidinalkaloiden-in-lebensmitteln.pdf (12.02.2016)

[2] https://de.wikipedia.org/wiki/Codex_Alimentarius (12.02.2017)

[3] www.bfr.bund.de/cm/343/pyrrolizidinalkaloide-in-lebensmitteln-aktivitaeten-des-bll-und-positionen-der-lebensmittelwirtschaft.pdf (12.02.2017)

[4] http://ehtpa.eu/pdf/cop-revision-20090245.pdf

[5] www.bfr.bund.de/cm/343/bestimmung-von-pyrrolizidinalkaloiden.pdf

* G. Deußing: Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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