HPLC-Proben vollständig trocknen

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In den letzten Jahren hat sich die Aufreinigung chemischer Proben mithilfe der HPLC immer weiter durchgesetzt. Gerade in der pharmazeutischen Industrie ist sie zurzeit eine häufig verwendete Methode. Gleichzeitig mit Zahl der HPLC-Aufreinigungen ist auch die Zahl der Proben drastisch gestiegen, was dazu führt, dass sogar bei der massenspezifischen Detektion mehr als eine Fraktion je Probe generiert wird.??Nach der Aufreinigung werden die Probenfraktionen normalerweise getrocknet, in minimalem Lösungsmittelvolumen resuspendiert und mehrere Fraktionen in einen (kleineren) Probencontainer (Vial) abgefüllt und gelagert. In diesem Prozess sind meist auch analytische Methoden enthalten, welche das Trockengewicht des Ertrages bestimmen und die Unterverteilung von Proben für die NMR-Analyse betreffen. ??Bis vor kurzem fielen den Wissenschaftler beim Phamaunternehmen Kudos Pharmaceuticals immer wieder Proben auf, die nach der Aufreinigung nicht richtig getrocknet waren. Welche Lösung für dieses Problem gemeinsam mit Kollegen bei Astra Zeneca entwickelt wurde ist nachfolgend beschrieben.??Trocknung „hartnäckiger“ Proben??Wie bei vielen anderen pharmazeutische Unternehmen fallen auch bei Kudos Pharmaceuticals regelmäßig Proben an, die trotz der Aufreinigung nicht richtig trocken sind. Typischerweise verkleben diese „hartnäckigen“ Proben im Vial oder bilden ein Öl (s. Abb. 1) was zu weiteren Problemen beim Handling der Proben führt. So kann beispielsweise, das Gewicht der Proben nicht bestimmt werden - die Proben werden deshalb verworfen. Hinzu kommt: Lösemittelrückstände führen zu einem schnelleren Abbau der Verbindungen - ein Problem, das bei trockenen Proben nicht auftitt. ??Die Labormitarbeiter bei Kudos und Astra Zeneca haben deshalb eine neue Methode zur Probentrocknung entwickelt, die sowohl das Lösungsmittel-Restvolumen enfernt als auch die Probleme beim Sammeln von Fraktionen löst. Abbildung 3 zeigt ein Flussdiagramm mit den detaillierten Arbeitschritten. ??Evaporation bringt die Lösung??Dank dieser neuen Methode erhält man Proben mit einer „krümeligen“ Feststoffkonsistenz, die vollständig getrocknet und leicht zu handhaben sind - bei mehr als 90 Prozent der vormals schwierig zu handhabenden Proben haben die Wissenschaftler gute Resultate erzielt. ??Für die geringe Anzahl an Proben, die sich in 1,4 Dioxan nicht lösen, wurden allerdings Alternativen benötigt. Zwei Methoden wurden erfolgreich getestet und eingesetzt. Entweder wurden die Proben zunächst in einer kleinen Menge Methanol (2 bis 3?ml) „rückgelöst“, dann mit etwa 10?ml Wasser versetzt und anschließend im Genevac HT-24 (s. Abb. 2) getrocknet. Dabei vermeidet eine Vakuumrampe das „explosionsartige Sieden“, das auftreten kann bevor das Wasser komplett einfriert. ??Vakuum trocknet zuverlässig??Alternativ dazu wurden die Proben in einer kleinen Menge tertiärem Butanol rückgelöst und anschließend bei vollem Vakuum getrocknet. Der Vorteil dieser Methode: Tertiäres Butanol gefriert bei +25?°C und eignet sich daher sehr gut für eine Lyophillisation (Gefriertrocknung).??Diese Methoden liefern zwar nicht immer einen leichten Feststoff, aber die kristalline Probe ist sowohl trocken als auch abwiegbar. Theoretisch wäre es auch möglich die HPLC-Fraktion direkt vom Fraktions-Sammler zu lyophillisieren, dies würde jedoch ein Feststoff-Handling zum Poolen der Fraktionen voraussetzen, was sich nicht unbedingt für eine Automatisierung eignet.??Schlussfolgerung??Dank dieser neuen Methoden stehen die vormals schwierig zu trocknende Proben jetzt in einer völlig getrockneten und damit leicht zu handhabenden Vorlage zur Verfügung. Der bereits bei Kudos eingesetzte Genevac HT-24 Zentrifugalevaporator macht für Astra Zeneca die Anschaffung zusätzlicher Laborgeräte wie Gefriertrockner unnötig. Die Entwicklung und Anpassung der Vakuumtechnik an die Bedürfnisse von Astra Zeneca ermöglicht es Kudos, komplett getrocknete und daher exakt abzuwiegende Proben zu liefern.

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