Metallionen auf der Spur

RÜCKSTANDS- SPURENANALYTIK SPECIAL Metallionen auf der Spur

01.02.2006Autor / Redakteur: KNUT RURACK* UND CHRISTIAN MONTE* / LP-Redaktion

Die Fluoreszenzspektroskopie ist eine hoch empfindliche, schnelle und zerstörungsfreie Analysenmethode und eignet sich speziell auch für die vor-Ort- und In-situ-Analytik. Durch den Einsatz gezielt entwickelter Fluoreszenzsonden lassen sich mit dieser Methode selbt nicht fluoreszierende Analyten, wie z.B. Schwer- und Übergangsmetallionen mit hoher Selektivität und Sensitivität detektieren.

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Ein Fluoreszenzsignal übermittelt Informationen durch eine Vielzahl an Parametern wie Fluoreszenzintensität, -lebensdauer oder -anisotropie. Je nach Wahl der instrumentellen Komponenten wie Lichtquelle und Detektor sowie der eingesetzten Fluoreszenzsonden lässt sich eine Nachweismethode auf eine bestimmte Messgröße hin optimieren. Die Entwicklung eines erfolgreichen Nachweisverfahrens liegt dabei an der Schnittstelle von supramolekularer (Bio-)Chemie, Photophysik und Optikdesign / Optoelektronik.

Schwer- und Übergangsmetalle in ionischer Form gehören mit zu den ältesten, bekanntesten und bedeutsamsten Umweltkontaminanten, die schon im (Ultra) Spurenbereich wirksam sein können [1]. In Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Oxidationsstufe und chemischen Umgebung kann die Wirkung auf ein spezifisches Umweltkompartiment oder einen Zielorganismus sehr verschieden sein, weshalb die Aufklärung der molekularen Mechanismen ihrer Aufnahme, ihres Metabolismus und ihrer Wirkung gerade in letzter Zeit verstärkt im Fokus der medizinischen Chemie und Toxikologie stehen.

Wichtig bei der quantitativen Bestimmung von authentischen Gehalten an Schwer- und Übergangsmetallionen sowohl in einem Umweltmedium als auch in biologischen Proben ist die Vermeidung von verfälschenden Einflüssen bei Probenahme, Transport sowie Aufarbeitung und Messung im Labor z.B. in Hinsicht auf Oxidationszustand oder Umkomplexierung, insbesondere wenn Aussagen im Bereich der Spurenanalytik gemacht werden sollen. Die Probleme, die bei solchen Fragestellungen und einer Probenbehandlung analog zum herkömmlichen analytischen Ablauf zwischen Entnahmeort und Messlösung auftreten können, sind vielfältig und sollen hier nicht weiter erörtert werden, sondern können in und vergleichbarer Literatur nachgeschlagen werden. Ein möglicher Weg, viele dieser potenziellen Fehlerquellen zu umgehen, ist die vor-Ort-Analytik z.B. direkt in einem Aquifer, Abwasserkanal oder in Gefäßbahnen eines lebenden Organismus. Als sehr nachweisstarke Messmethode hat sich hier in den letzten Jahren vor allem die Fluorometrie in Verbindung mit faseroptischen Sensoren qualifizieren können.Anforderungen an verwendete FluoreszenzsondenBei Analyten ohne Eigenfluoreszenz wie den meisten relevanten Schwer- und Übergangsmetallionen müssen zum Nachweis Fluoreszenzsonden eingesetzt werden. Bei diesen (meist) organischen Molekülen ändert sich das Absorptions- und/oder Fluoreszenzverhalten nach Komplexierung eines Metallions, wobei sowohl spektrale Verschiebungen als auch Änderungen der Fluoreszenzquantenausbeute, -lebensdauer und -anisotropie auftreten bzw. zur Detektion ausgenutzt werden können. Bei der Entwicklung solcher Sonden für diese Analytklasse stehen generell drei zentrale Aspekte im Vordergrund. Zum einen kann eine hohe Sensitivität des Nachweises am besten realisiert werden, wenn ein bestehendes Fluoreszenzsignal durch die analytische Reaktion verstärkt bzw. ein neues, intensives Signal generiert wird. Des Weiteren sind paramagnetische Metallionen wie Cu2+ oder Fe3+ und Schwermetallionen wie Hg2+ oder Pb2+ herkömmlicher Weise starke Fluoreszenzlöscher, was in geeigneter Weise unterbunden werden sollte. Drittens schließlich sollte der photophysikalische Prozess, der im Sondenmolekül das analytische Signal generiert, möglichst effektiv sein, d.h., die Sonde sollte, ähnlich wie eine Lampe bei Betätigung des Lichtschalters, durch Komplexierung vom AUS- (schwach oder nicht fluoreszent) in den AN-Zustand (stark fluoreszent) überführt werden. Einige der in der letzten Zeit etablierten Konzepte zum Design von leistungsstarken Fluoreszenzsonden, die diese Analyten durch ein „Aufleuchten“ nach Bindung anzeigen, werden hier kurz vorgestellt.Metallionen gesteuertes „Anschalten“ der FluoreszenzDie erste Strategie zu extrem starken AN-Schaltsignalen beruht auf der „virtuellen“ Entkopplung von einer Rezeptor- und einer Fluorophoreinheit, wobei F für sich genommen typischerweise eine starke Fluoreszenz zeigen sollte. Hier ist nun die Metallionen komplexierende R-Einheit so gewählt, dass sie im unkomplexierten Zustand durch einen schnellen Elektronentransfer (ET) in das nach Anregung freie Grundzustandsniveau von F die Fluoreszenz des angeregten F verhindern bzw. löschen kann. Durch die direkte Kopplung beider Einheiten über nur eine Einfachbindung ist garantiert, dass ein entfernungsabhängiger Prozess wie ein ET sehr effizient verlaufen kann. Auf der anderen Seite sorgt die nahezu orthogonale Anordnung beider Einheiten dafür, dass diese im elektronischen Grundzustand nicht Wechsel wirken können. Diese „virtuelle“ Entkopplung verhindert außerdem einen direkten, die Fluoreszenz löschenden Einfluss des Metallions (d-Übergänge, Triplettübergänge) nach Komplexierung mit R. Die Funktionsweise bei Detektion eines Metallions ist nun folgende: Im unkomplexierten Zustand ist die Fluoreszenz der Sonde 1 durch den ET von R zu F mit einer Quantenausbeute von unter 0,1 Prozent äußerst gering. Nach Komplexierung eines positiv geladenen Metallions M an R wird die Elektronendichte auf der Untereinheit R dramatisch abgesenkt, der Elektronentransfer nach F effizient unterdrückt, und damit die typische, starke Fluoreszenz von F wiederhergestellt (s. Abb. 1B und 1C). Hierbei können Fluoreszenzverstärkungen von zwei bis drei Größenordnungen erzielt werden. Da außerdem die Fluoreszenzlebensdauer der Komplexe direkt von der Ladungsdichte des M und der Stärke der koordinativen Bindung abhängt, können verschiedene Ionen anhand der Fluoreszenzlebensdauer ihrer Komplexe simultan detektiert werden. Kürzlich wurde ein Fluoreszenzindikator solchen Typs z.B. erfolgreich zum Hg2+-Screening in Fisch eingesetzt.Eine zweite Strategie beruht nicht auf der Bildung eines stark emissiven Komplexes, sondern arbeitet analog eines Dosimeters, genauer, eines regenerierbaren Chemodosimeters 2. Der tief gefärbte und stark fluoreszierende Farbstoff S ist auf einem silikatischen Träger fixiert und kann durch eine spezifische Reaktion mit einem kurzkettigen Thiol TH in seine farblose Leukoform L überführt werden. Diese Passivierungschemie bzw. L sind wiederum so konzipiert, dass nur die selektive Reaktion mit Hg2+ den originären Farbstoff S freisetzt. Dabei schlägt die Farbe des Teststreifenprototyps, der in dieser Arbeit verwendet wurde, von farblos nach blau um, und gleichzeitig kann mit der entsprechenden Nachweistechnik das typische Fluoreszenzsignal von S bei 670 nm abgefragt werden. Mit einer sehr einfachen Teststreifenmethode lässt sich so z.B. Hg2+ bis in den ppb-Bereich detektieren.Biosensorische Ansätze, die auf dem Einsatz von metallregulierenden Proteinen und Fluoreszenzfarbstoffen beruhen, haben in den letzten Jahren ebenfalls an Bedeutung gewonnen. Beispielsweise konnte ein Pb2+-regulierendes Protein (PbrR) des Bakteriums Ralstonia metallidurans, welches tolerant gegenüber hohen Gehalten an toxischen Schwermetallen ist, in eine Fluoreszenzsonde umgewandelt werden, die eine sehr hohe Selektivität und Nachweisempfindlichkeit für Pb2+ zeigt. Da sämtliche Gene dieses Bakteriums, die die Pb2+-Resistenz bedingen, von PbrR gesteuert werden, wurde ein 25-mer DNA-Doppelstrang, der die Bindungsstelle für PbrR beinhaltet, synthetisiert und dabei in einem zentralen Basenpaar eine fluoreszierende Base A eingebaut. Diese ist im intakten Doppelstrang bei Basenpaarung durch p-p Wechselwirkung mit den nächsten Nachbarn bzw. durch ET zu einer Nachbarbase gelöscht. In Gegenwart von PbrR ist der Doppelstrang unverändert, die Emission ebenso gelöscht. Ist allerdings Pb2+ anwesend, wird der Doppelstrang aufgebrochen und der ungepaarte Basen-Fluoreszenzfarbstoff zeigt seine starke Fluoreszenz.Diese drei Beispiele zeigen nicht nur generelle Aspekte der Sondenentwicklung, sondern geben auch einen kleinen Ausblick, wie der Anwendungsbereich die Wahl bzw. das Design einer Sonde beeinflussen. Während beispielsweise die schnelle und reversible Gleichgewichtseinstellung in System 1 zwischen <=>1+M 1-M ein direktes Monitoring zulässt, arbeitet System 2 wie ein klassischer diskontinuierlicher Indikator, der akkumulativ ein Signal erzeugt und erst nach Regenerierung wieder einsatzfähig wird. Bei Biosensoren schließlich hängt die Reversibilität stark von der Affinität des biologischen Mediators ab.Verwendungsmöglichkeiten in der mobilen AnalytikNeben dem Nachweis vor Ort in einem Behältnis oder durch Eintauchen eines Teststreifens sind vor allem faseroptische Sensoren hervorragend für die Echtzeitmessung direkt am Probenort geeignet. Faseroptische Methoden haben in Verbindung mit Multiplexern auch ein hohes Potenzial im Bereich der Prozessanalytik. Hier wird es z.B. möglich, mit einer zentralen Messeinrichtung eine hohe Zahl von Kontrollpunkten zu beobachten, die nicht direkt zugänglich sein müssen. Wie an Hand einer Reihe von kommerziell erhältlichen faseroptischen Sensoren zur pH- (meist kolorimetrisch) und Sauerstoff-Messung (meist fluorometrisch, z.B. FOXY Oxygen Sensor von Ocean Optics Inc., s. InfoClick) deutlich wird, haben solche Verfahren bereits einen hohen Grad an Praxistauglichkeit erlangt. Im Falle der Detektion von Fluoreszenzabklingzeiten haben Fasersensoren allerdings den Nachteil, dass die zeitliche Auflösung in den Kurzzeitdomänen wie beispielsweise dem unteren Nanosekundenbereich schlechter werden kann. Umgehen lassen sich solche Nachteile in der Regel durch die Auswahl oder Entwicklung einer Farbstoffeinheit mit entsprechend längerer Fluoreszenzabklingzeit für das Indikatormolekül oder -ensemble. Im Bereich der Metallionenanalytik sind Sondensysteme wie die oben dargestellten durchaus für die fluorometrische und kolorimetrische Detektion mittels Faseroptiken geeignet. Als letztes Beispiel soll daher kurz ein faseroptischer (Bio-)Sensor vorgestellt werden. Kürzlich konnte durch Funktionalisierung eines Metalloproteins mit einem stark im roten Spektralbereich absorbierenden und fluoreszierenden Farbstoffes ein faseroptischer Biosensor für die Bestimmung von freiem Cu2+ in Seewasser im Picomol-Bereich realisiert werden, bei dem die Anregung mittels einer 660 nm-Laserdiode und die Detektion der Änderung der Fluoreszenzlebensdauer des Farbstoff-Protein-Konjugats phasenfluorometrisch erfolgte. Im ungebundenen Zustand klingt die Fluoreszenz des Farbstoffes mit 3,2 ns ab, bei Anwesenheit des paramagnetischen Cu2+ im benachbarten Proteinrezeptor wird diese auf 0,3 ns reduziert. Damit einhergehend ändern sich der Phasenwinkel und die Modulation des Signals dramatisch. Zeng et al. konnten so über die Änderung der Fluoreszenzabklingzeit die tidenabhängige Konzentration an freiem Cu2+ in einem küstennahen See mit Meerwasserzufluss und Sportboothafen messen. Quelle der Cu2+-Kontamination waren vor allem Antifouling-Anstriche von Sportbooten, so dass mit Einsetzen der Ebbe jeweils ein Anstieg des Cu2+-Gehaltes im See messbar war.In diesem Beitrag haben wir einen Einblick gegeben, wie die Entwicklung erfolgreicher Verfahren für den optischen Nachweis von Schwer- und Übergangsmetallionen im Spurenbereich an der Schnittstelle von supramolekularer (Bio-)Chemie, Photophysik und faseroptischem Design gelingen kann. Diese Messmethodik ist dabei hoch empfindlich, schnell und zerstörungsfrei und eignet sich daher speziell für die vor-Ort-Analytik. Um zukünftig eine stärkere Verbreitung von faseroptischen Sensoren für Metallionen zu ermöglichen, ist vor allem der Einbau von (bio-)chemischen Sonden in die aktiven Faserelemente unter Berücksichtigung praxisrelevanter Anforderungen gefragt.

METALLIONEN ALS FLUORESZENZLÖSCHERParamagnetische Metallionen induzieren durch ihre energetisch tief liegenden, teils unbesetzten d-Schalen in der Regel einen sehr effizienten Elektronen- oder Energietransfer und führen so zur strahlungslosen Deaktivierung von vielen ihrer Komplexverbindungen mit organischen Farbstoffen. Bei Schwermetallionen wird die Fluoreszenzlöschung durch eine erhöhte Spin-Bahn-Kopplung und damit einem verstärkten Singulett-Triplett-Übergang im Fluorophor bewirkt.* Div. I.5, Bundesanstalt für Materialforschungund -prüfung (BAM), 12489 Berlin

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