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BIOANALYTIK

Multifunktionelles Polymer für Festphasen-Extraktion

09.12.2004 | Autor / Redakteur: ANDREA JUNKER-BUCHHEIT* UND RUDOLF MEHRHOFF* / Gerd Kielburger

Abb.1: Wiederfindungen ausgewählter Arzneimittel (Vergleich Focus mit anderem SPE-Material).
Abb.1: Wiederfindungen ausgewählter Arzneimittel (Vergleich Focus mit anderem SPE-Material).

Betrachtet man die einzelnen Verfahrensschritte einer Analyse, so ist die Probenvorbereitung der zeitlimitierende Schritt, der zudem die Richtigkeit und Präzision des Analysenverfahrens entscheidend beeinflusst. Die Zielsetzung der Probenvorbereitung ist dabei, die zu bestimmenden Verbindungen anzureichern und gleichzeitig störende Komponenten – aus Reaktionsansätzen oder biologischen Matrices – zu entfernen.

Betrachtet man die einzelnen Verfahrensschritte einer Analyse, so ist die Probenvorbereitung der zeitlimitierende Schritt, der zudem die Richtigkeit und Präzision des Analysenverfahrens entscheidend beeinflusst. Die Zielsetzung der Probenvorbereitung ist dabei, die zu bestimmenden Verbindungen anzureichern und gleichzeitig störende Komponenten – aus Reaktionsansätzen oder biologischen Matrices – zu entfernen.

Gerade bei der Analytik von Arzneistoffen kommt der „richtigen“ Probenvorbereitung eine erhebliche Bedeutung zu. Vorzugsweise werden Festphasen-Extraktionskartuschen (SPE, Solid-phase Extraction) eingesetzt, die aufgrund bestimmter Wechselwirkungen den Analyten binden und es ermöglichen, die störenden Verunreinigungen durch gezielte Waschschritte zu entfernen. Der Analyt wird durch Elution mit einem geeigneten Lösemittel von der stationären Phase desorbiert und ist dann für weitere Analysenverfahren vorbereitet.

Als gebräuchlichste Phasen bei der Probenvorbereitung von biologischen Proben haben sich - neben polymeren Trägern - kieselgelgebundene Reversed-Phase Materialien durchgesetzt. Die RP-SPE mit C18- und C8-Phasen basiert auf unpolaren Retentionsmechanismen und ist für saure, neutrale und basische Substanzen niedriger bis mittlerer Polarität aus biologischen Flüssigkeiten sehr gut geeignet.

Problematisch kann sich bei matrixbelasteten Proben die geringe Selektivität von alkylmodifizierten Phasen auswirken, so dass infolge von Überladung mit Matrixkomponenten Analytdurchbrüche auftreten und die Wiederfindung reduziert wird. Darüber hinaus ist die Retention von polaren Substanzen oftmals unbefriedigend. Polymere Phasen, z.B. auf Basis von Polystyrol-Divinylbenzol oder Divinylbenzol-N-Vinylpyrrolidon, haben sich aufgrund höherer Kapazität bei gleichzeitig verringerter Sorbensbettmasse für die Anreicherung polarer Metaboliten aus Körperflüssigkeiten bewährt.

Diese Packungsmaterialien weisen hohe Probenkapazität, Stabilität im gesamten pH-Bereich und gute Flusscharakteristik auf. Allerdings ist bei den herkömmlichen Polymeren der Grad der erreichten Extraktreinheit oftmals nicht zufriedenstellend. Es werden generische Methodenverfahren mit z.T. unselektiven Waschschritten eingesetzt, die häufig nur zu ungenügender Matrixabtrennung führen. Die Folge davon ist, dass bei der LC/MS eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Ionensuppression auftritt: Die Ionenausbeute wird verringert und die Empfindlichkeit nimmt ab. Ebenso kann es zu einer Überlagerung der Analyten durch Matrixkomponenten kommen, so dass chromatographische Trennbedingungen geändert werden müssen.

Eine Weiterentwicklung für die SPE von polaren Analyten stellt Focus dar, eine polymere Phase, die hinsichtlich Selektivitätsbreite und Reinigungseffizienz, insbesondere auch bei Einsatz von LC/MS, deutlich verbesserte Ergebnisse liefert. Nachfolgend wird eine Charakterisierung typischer Eigenschaften gegeben.

Focus - eine multifunktionelle Phase für die SPE

Zielsetzung war es, eine stationäre Phase zu entwickeln, welche die Retention für polare Analyten verbessert und diese gleichzeitig für hydrophobe Begleitstoffe verringert - kombiniert mit hydrophilen Funktionalitäten, die eine ausreichende Benetzbarkeit mit der biologischen Probe ermöglichen. Um dieses zu erreichen, muss das SPE-Sorbens bestimmte Voraussetzungen erfüllen: Neben hydrophoben Wechselwirkungen müssen sowohl polare Interaktionsstellen als auch Wasserstoffdonatoren- und Wasserstoffakzeptoren-Positionen vorhanden sein.

Focus zeichnet sich durch eine neue polare Sorbenstechnologie („4in1“-Technologie) aus, die sehr gute Wiederfindungen für saure, neutrale und basische polare Analyten ermöglicht. Die bei Focus unter neutralen pH-Bedingungen wirksamen Retentionsmechanismen sind hydrophobe und polare Wechselwirkungen sowie Protonenakzeptor- und Protonendonator-Interaktionen. Im Vergleich zu anderen polymeren Sorbentien fungiert Focus u.a. als Protonen-Donator, wodurch die Retention basischer Substanzen entscheidend verbessert wird. Diese stärkere Retention bewirkt, dass ein Waschen mit einem höheren Gehalt an organischem Lösemittel möglich ist („Power Rinse“).

Dadurch werden reinere Extrakte für ein breites Spektrum von Arzneiwirkstoffen erzielt, weil sich unerwünschte, unpolare Matrixbegleitstoffe beim Waschschritt eliminieren lassen. Systematische Vergleichsuntersuchungen mit kommerziell verfügbaren Polymerphasen anhand ausgewählter Pharmaka unterschiedlicher Log P (Lipophilie)-Werte in Plasma belegen eindeutig, dass mit Focus im Vergleich zu anderen, kommerziell verfügbaren Polymeren höhere Wiederfindungen aufgrund verbesserter Analytretention erhalten werden (Abb. 1).

Abbildung 2 zeigt anschaulich, dass Focus einen wesentlich reineren Extrakt liefert als das alternative Produkt „OP“ und damit die Ionensuppression deutlich verringert. Das Erreichen einer hohen Extraktreinheit ist durch eine Waschlösung höherer Elutionskraft möglich. Dadurch werden endogene, unpolare Matrixinterferenzen entfernt, jedoch ohne Verluste an Analyten. Experimente zur Post-column-Infusion zeigen, dass Focus die Ionensuppression im Vergleich zu Polymer „OP“ vermindert, wie man in Abildung 3 erkennen kann. Da Störsubstanzen aus der Matrix entfernt werden, die gewöhnlich mit schnell eluierenden polaren Verbindungen interferieren, müssen die chromatographischen Trennbedingungen auf der Säule nicht verändert werden. Dadurch resultieren schnelle LC-Methoden.

Elution mit Methanol, Acetonitril, Wasser und TFA

Focus erlaubt auch eine sehr effiziente Elution mit geringen Elutionsvolumina. Entsprechend dem multifunktionellen Charakter von Focus wird ein Vielkomponentengemisch aus Methanol, Acetonitril, Wasser und TFA verwendet (Tabelle 1). Säure/Basenzusatz ist notwendig, um basische/saure Analyten zu protonieren/deprotonieren. Wasser wird zugesetzt, um Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Analyt und stationärer Phase aufzuheben, Acetonitril hebt Dipol-Dipol-Wechselwirkungen auf und Methanol sorgt dafür, dass unpolare Interaktionen beseitigt werden. Daraus ergeben sich Standardmethoden für Plasma- und Serumproben, die im Hinblick auf den jeweiligen Säure- oder Basen-Charakter der zu reinigenden Verbindungen modifiziert werden.

Das neue Focus-Sorbens unterliegt einer rigorosen Qualitätskontrolle. Es werden nicht nur die Einhaltung physikochemischer Parameter wie spezifische Oberfläche und Porenweite kontrolliert; weitere Qualitätsparameter sind z.B. die eluierbaren Bestandteile, die Prüfung der Reinheit sowie die Sicherstellung der Bindungskapazität gegenüber ausgewählten Analyten. Darüber hinaus wird eine sehr gleichmäßige Flussrate durch eine enge Partikelgrößenverteilung garantiert. Insbesondere bei Einsatz von 96-Well-Platten zahlt sich dieses Leistungskriterium durch reproduzierbare Wiederfindungen infolge gleichmäßiger Flussraten aus.

Verbesserte Wiederfindung, reinere Extrakte

Focus ist aufgrund seiner vielfältigen Retentionsmechanismen ein leistungsstarkes Tool zur Festphasen-Extraktion von pharmazeutisch relevanten Verbindungen aus Serum und Plasma - sowohl für die Wirkstoffentwicklung als auch bei vorklinischen und klinischen Studien. Basierend auf einer neuartigen Sorbenstechnologie, weist diese neue stationäre Phase wesentliche Vorteile bei der Extraktion von polaren Substanzen auf. Verschiedene Retentionsmechanismen sorgen für verbesserte Wiederfindung, reinere Extrakte und verringerte LC/MS-Ionensuppression.

Experimentelle Bedingungen

Die Plasmaproben wurden jeweils mit den aufgeführten Wirkstoffen in einer Konzentration von 100 ng/mL dotiert und nachfolgend 1:1 mit Wasser verdünnt. Es wurden jeweils 200 µL Probenlösung auf die zuerst mit 1 mL Methanol und dann mit 1 mL Wasser konditionierten 10 mg Wells aufgegeben.Nach der Probenaufgabe wurden die einzelnenWells mit jeweils 1mLWasser und danach mit 1 mL zehnprozentigem Acetonitril (Power Rinse) gespült.

Eluiert wurde mit 1 mL einer Lösemittelmischung aus Methanol-Acetonitril-1%ige TFA-Lösung (60:30:10). Zur Bestimmung der Wiederfindungen aus Plasma wurde analog aufgearbeitet und die Standardlösungen nachder Elution hinzu dotiert. Alle anfallenden Extrakte wurden eingeengt und in jeweils 150 µL mobile HPLC-Phase aufgenommen. Nachfolgend wurden jeweils ein 15 µLAliquot in das LC-MS/MS-System injiziert. Für die Aufarbeitung der Plasmaproben mit dem zu vergleichenden SPEMaterial („OP“) wurde die empfohlene Vorschrift des Herstellers exakt eingehalten.

*Dr. A. Junker-Buchheit und Dr. R. Mehrhoff, Varian Deutschland GmbH, 64229 Darmstadt

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