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Passende Säulenhardware für die Oligonukleotid-Analytik Oligonukleotide: Hardware als Weg zur optimalen Chromatographie

Von Ann Marie Rojahn und Dr. Daniel Eßer, Produktspezialistin und Produktmanager Analytische Chromatographie, YMC Europe GmbH

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Die Corona-Pandemie hat es mehr als deutlich gemacht: Oligonukleotid-basierte Medikamente gewinnen in der Medizin immer mehr an Bedeutung. Forschung und Entwicklung wie Qualitätskontrolle benötigen daher robuste und hochempfindliche Analysenmethoden. Die Ionenpaar-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (IP-RP) gilt hierbei als Goldstandard – doch es kommt auf die passende Hardware an.

Säulen mit robuster Stationärphase und bioinerter Hardware stellen die ideale Lösung für die Ionenpaar-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (IP-RP) von Oligonukleotiden dar.
Säulen mit robuster Stationärphase und bioinerter Hardware stellen die ideale Lösung für die Ionenpaar-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (IP-RP) von Oligonukleotiden dar.
(Bild: © ktsdesign - stock.adobe.com; YMC Europe)

Die Nukleinsäuren RNA und DNA kommen nicht nur auf natürliche Weise in Zellen vor. Sie können auch Wirkstoffe von Medikamenten sein. Im Zuge der Corona-Pandemie besondere Bekanntheit erlangt, haben Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten, die mRNA enthalten. Doch es gibt auch einige Medikamente, die RNA- oder DNA-Moleküle zu therapeutischen Zwecken enthalten.

Aktuell sind siebzehn Oligonukleotid-basierte Medikamente mit unterschiedlichen Indikationen in den USA bzw. Europa zugelassen [1]. Oligonukleotide gewinnen in der Medizin immer mehr an Bedeutung [2,3]. In Forschung und Entwicklung sowie Qualitätskontrolle werden daher robuste und hochempfindliche Analysenmethoden benötigt. Dabei ist die Ionenpaar-Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (IP-RP) der Goldstandard für die Charakterisierung von Oligonukleotiden und deren Nebenprodukte [4].

Tabelle 1: In der EU zugelassene therapeutische Medikamente auf RNA-Basis
Tabelle 1: In der EU zugelassene therapeutische Medikamente auf RNA-Basis
(Quelle: www.vfa.de, Stand 25.10.2022)

Durch das hydrophile und negativ geladene Rückgrat der Oligonukleotide ist die konventionelle RP-LC eher ungeeignet. Denn Oligonukleotide haben naturgemäß nur eine geringe Wechselwirkung mit einer hydrophoben Phase. Werden allerdings Ionenpaarreagenzien der mobilen Phase zugesetzt, bilden diese mit den Oligonukleotiden entsprechend neutrale Ionenpaare. Dadurch können auch geladene Oligonukleotide mittels RP nach ihrer Hydrophobizität getrennt werden. Dies hat einen weiteren interessanten Vorteil. Erfolgt die IP-RP bei erhöhter Temperatur, liegen Oligonukleotide linear vor. Dann ist sogar eine längenbasierte Trennung zu beobachten [5].

Abb. 1: Einfluss-Faktoren auf die Oligonukleotid-Analytik mittels IP-RP.
Abb. 1: Einfluss-Faktoren auf die Oligonukleotid-Analytik mittels IP-RP.
(Bild: YMC Europe)

Um ideale Ergebnisse zu erhalten, müssen verschiedene Einflüsse berücksichtigt werden (s. Abb. 1). So ist nicht nur die Wahl des Ionenpaar-Reagenzes und des organischen Lösungsmittels entscheidend, sondern auch deren Konzentration und somit auch der pH-Wert des Eluenten. Die Säulentemperatur sowie der ange­wendete Gradient haben ebenfalls einen Einfluss auf die Analyse. Zudem muss die optimale stationäre Phase – in Bezug auf Modifikation und Porengröße – und die geeignete Säulenhardware gewählt werden.

Im Folgenden werden wichtige Aspekte einer reibungslosen Oligonukleotid-Analyse systematisch vorgestellt. Ein besonderes Augenmerk wird dabei auf die verwendete Säulen-Hardware gelegt. Denn Säulen mit robuster Stationärphase und bioinerter Hardware stellen die ideale Lösung für Oligonukleotide dar.

Oligonukleotide als Therapeutika

Wie natürliche Nukleinsäuren bestehen Oligonukleotid-basierte RNA- und DNA-Wirkstoffe aus einer genau festgelegten Abfolge (Sequenz) von Nukleotiden. Bis 100 Bausteine große RNA- und DNA-Wirkstoffe heißen Oligonukleotide. Die Molekülstruktur dieser Nukleotide ist typischerweise in einigen Punkten gegenüber der biologischen modifiziert, insbesondere um sie vor allzu schnellem Abbau im Körper zu schützen. Stand 25.10.2022 sind in der EU acht therapeutische Medikamente auf RNA-Basis zugelassen (s. Tab. 1). Quelle: www.vfa.de

Die optimale mobile Phase

Üblicherweise wird Triethylamin (TEA) in Kombination mit 1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP) mit Methanol als organischem Modifier verwendet. Dieses Puffersystem gewährleistet gute Auflösungen und eine hohe Sensitivität in der Elektrosprayionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS). Im Rahmen einer systematischen Betrachtung der mobilen Phase wurde eine Mischung aus vier RNAs (14-21mer) getestet. Dazu wurde eine bioinerte Widepore-Säule, YMC-Accura Triart Bio C18, verwendet.

Abb. 2: Optimale Kombination der TEA- und HFIP-Konzentration bei pH 8 für die Trennung einer RNA-Mischung 
(14, 17, 20, 21 mer).
Abb. 2: Optimale Kombination der TEA- und HFIP-Konzentration bei pH 8 für die Trennung einer RNA-Mischung 
(14, 17, 20, 21 mer).
(Bild: YMC Europe)

Zunächst wurde der Einfluss verschiedener Alkyl­amine als Ionenpaarreagenz unter Zusatz von HFIP in diversen Konzentrationen untersucht. Der Vergleich von Triethylamin (TEA), n-Butylamin (BA), Dibutylamin (DBA) und Hexylamin (HA) ergab, dass mit TEA durchweg gute Ergebnisse erzielt wurden. Teilweise konnten bessere Auflösungen mit anderen Alkylaminen erreicht werden. So lieferten DBA und HA bei einer Konzentration von 15 mM und 400 mM HFIP höhere Auflösungen. Die ideale Kombination ist letztendlich von der Art des Oligonukleotids abhängig.

Bei weiteren Tests wurde die Konzentration von TEA (1 bis 30 mM) und damit auch der pH (somit pH 7,4 bis 8,9) variiert. Die HFIP-Konzentration wurde dabei auf 100 mM festgesetzt. Bis zu einer Konzentration von 8 mM TEA (pH 8,3) wurde ein Anstieg der Retentionszeit beobachtet. Darüber hinaus verkürzte sich die Retentionszeit, womit sich auch die Auflösung verschlechterte. Die besten Ergebnisse wurden bei einem pH-Wert von etwa 8 erreicht, sodass damit genauere Betrachtungen durchgeführt wurden. Die Konzentrationen von HFIP wurden ebenfalls variiert, sodass ein pH-Bereich von 7,8 bis 8,3 eingestellt wurde. Im Vergleich zeigte sich, dass mit hohen Konzentrationen beider Komponenten (15 mM TEA und 400 mM HFIP) die besten Auflösungen erhalten wurden (s. Abb. 2). Im Gegensatz zur hier eingesetzten UV-Detektion können für die Detektion mittels MS geringere Konzentrationen geeigneter sein.

Bei der Untersuchung der Temperatur im Bereich von 25 °C bis 90 °C wurde eine Vergrößerung der Auflösung mit steigender Temperatur festgestellt. Es wurden jedoch bereits ab 25 °C ausreichende Auflösungen erreicht. Da die Stabilität des Oligonukleotids berücksichtigt werden muss, kann eine Verwendung von hohen Temperaturen unter Umständen nicht möglich sein.

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Die Variation der Gradientensteigung von 0,4 Prozent bis 2,0 Prozent Methanol/min lieferte in jedem Fall eine gute Auflösung, wobei ein flacher Gradient zu einer größeren Auflösung führt. Mit einem steileren Gradienten hingegen können schnellere Analysen mit höherer Sensitivität durchgeführt werden.

Daraus lässt sich ableiten, dass eine gute Retention und Auflösung unter Verwendung von TEA-HFIP mit hoher Konzentration bei einem pH-Wert um die 8 erzielt werden kann. Jedoch ist der Typ und die Konzentration des Ionenpaar-Reagenzes stark abhängig von den untersuchten Oligonukleotiden. Als optimaler Ansatzpunkt hat sich eine Temperatur von 60 °C herausgestellt. Die Gradientensteigung hat einen weniger starken Einfluss, kann aber zur weiteren Optimierung herangezogen werden. Diese mit unmodifizierten Phosphodiester-Oligonukleotiden ermittelten Bedingungen, können im Übrigen auch auf die häufig verwendeten Phosphorothioat-Oligonukleotide (PTOs) übertragen werden.

Die optimale stationäre Phase

In der Analytik von Oligonukleotiden werden spezielle Anforderungen an die stationäre Phase gestellt. Sie muss gemäß den oben beschriebenen Bedingungen besonders robust sein und auch hohen pH-Werten und Temperaturen standhalten können. Moderne Stationärphasen, die z. B. auf Hybridpartikeln basieren, bieten all dies: Stabilität im pH-Bereich 1 bis 12 sowie bei Temperaturen bis 90 °C. Ihre chemische und mechanische Stabilität beruht auf dem verwendeten Basispartikel, einem organisch-anorganischen Hybrid-Silica, in Kombination mit einem trifunktionalen Bonding und einem mehrfachen Endcapping.

Die bevorzugte Stationärphase für die Oligonukleotid-Analytik ist C18 – auch wenn in gewissen Fällen andere Modifikationen wie C8 oder Phenyl ebenfalls eine entsprechend gute Selektivität bieten. Ein wichtiger Parameter ist neben der eigentlichen Modifikation die Porengröße. Um deren Einfluss näher zu untersuchen, wurden verschieden lange RNA und DNA mit drei C18-Phasen unterschiedlicher Porengrößen analysiert: 80 Å (YMC-Triart C18 ExRS), 120 Å (YMC-Triart C18) und 300 Å (YMC-Triart Bio C18).

Abb. 3: Einfluss der Porengröße auf die Trennung bzw Retentionszeit und Peakbreite von verschieden langer DNA (Poly dT, 10-120mer)
Abb. 3: Einfluss der Porengröße auf die Trennung bzw Retentionszeit und Peakbreite von verschieden langer DNA (Poly dT, 10-120mer)
(Bild: YMC Europe)

Bei der Trennung von 14-21mer RNA zeigt die wide­pore Phase (300 Å) YMC-Triart Bio C18 kürzere Retentionszeiten als die anderen beiden C18-Phasen. Gleichzeitig bietet sie die beste Auflösung zwischen 20 und 21mer. YMC-Triart C18 mit der Standardpore zeigt eine bessere Auflösung für die kürzeren Oligonukleotide. Die kleine Pore der YMC-Triart C18 ExRS zeigt weder bei der Auflösung noch der Retention einen Vorteil.

Abbildung 3 zeigt die Trennung von unterschiedlich langen DNA-Fragmenten (10 bis 120mer) mit den oben genannten C18-Phasen. Auch große Oligonukleotide können offenbar vollständig in die 300 Å-Pore der YMC-Triart Bio C18 Phase gelangen und können somit ideal mit der Phase interagieren. Darüber hinaus werden geringere Retentionszeiten mit schärferen Peaks erzielt. Für kürzere Oligonukleotide (bis zu 30mer) zeigt YMC-Triart C18 mit der Standardporengröße einige Vorteile. Eine Pore von 80 Å wie bei der YMC-Triart C18 ExRS Phase ist hingegen offenbar nicht gut geeignet für die Analytik von Oligonukleotiden. Somit ist eine robuste und flexible Phase wie YMC-Triart Bio C18 mit großer Pore die erste Wahl.

Die optimale Säulenhardware

Edelstahl überzeugt durch eine hohe Belastbarkeit und Kompatibilität mit nahezu allen gängigen Lösungsmitteln in der (U)HPLC. Doch können Eluenten das Material korrodieren. Methanol und Acetonitril beispielweise können sogar mit titanbeschichteter Hardware zu einer Metall-Auswaschung mit entsprechend limitierter MS-Performance führen [6]. Die dadurch resultierende positiv geladene Oberfläche kann zu einer unerwünschten ionischen Wechselwirkung mit Analyten führen [7]. Damit ist eine konventionelle Säulenhardware für die IP-RP Analyse von Oligonukleotiden nur eingeschränkt geeignet. Denn das elektronenreiche Backbone der Oligonukleotide kann durch ionische Wechselwirkungen mit der positiv aufgeladenen Oberfläche irreversibel adsorbiert werden. Dadurch werden die Wiederfindung und die Peakformen negativ beeinflusst. Bei neutralem pH wird dieser Effekt weiter verstärkt, da Metalle unter diesen Bedingungen stärker elektropositiv sind [8].

Um dieses Problem zu umgehen und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, kann man HPLC-Systeme mit einer starken Säure passivieren oder mit einer ähnlichen Probe konditionieren. Alternativ werden auch Chelatoren wie EDTA verwendet, um die Metallionen zu maskieren. Diese Vorgehensweisen sind allerdings zeitaufwendig und können Nachteile wie Ionensuppression in der ESI-MS-Detektion mit sich bringen [9,10]. Außerdem ist eine Passivierung nicht endgültig und muss regelmäßig wiederholt werden. Zudem kann z. B. ein Wechsel zu deutlich längeren Oligonukleotiden oder anderen Modifikationen dazu führen, dass der Analyt erneut adsorbiert wird [11].

Eine deutlich vorteilhaftere Lösung ist es, (U)HPLC-Säulen und -Systeme mit bioinerten Materialien zu verwenden. Dabei macht die Säule mehr als 70 Prozent der mit den Analyten in Berührung kommenden Oberfläche aus [10]. Folglich führen bioinerte Säulenkörper und Fritten zu einer deutlich verbesserten Performance. Es gibt dabei verschiedene Lösungen auf dem Markt, wie ein bioinertes Oberflächen-Coating des Edelstahls, Edelstahlsäulen mit einem PEEK-Lining und PEEK-Fritten oder Titansäulen. Wobei es bei letzteren ebenfalls zu einer Auswaschung des Metalls und somit zu einer Vergiftung des Silicabetts kommen kann. Das ausgewaschene Titan kann eine ionische Bindung mit freien Silanolgruppen eingehen, was zur Adsorption der Analyten auf der stationären Phase führt. Diesen Effekt weisen demnach v. a. Stationärphasen ohne oder mit ungenügendem Endcapping auf.

Abb. 4: Durch die Verwendung bioinerter YMC-Accura Triart Säulen können im Gegensatz zu konventionellen Säulen verlässliche Analysen von der 1. Injektion an ohne 
Wiederfindungsverluste durchgeführt werden – hier am Bespiel von RNA-Markern 
(100 bis 1.000 Basen).
Abb. 4: Durch die Verwendung bioinerter YMC-Accura Triart Säulen können im Gegensatz zu konventionellen Säulen verlässliche Analysen von der 1. Injektion an ohne 
Wiederfindungsverluste durchgeführt werden – hier am Bespiel von RNA-Markern 
(100 bis 1.000 Basen).
(Bild: YMC Europe)

Eine bioinerte Säule ist also einer vorkonditionierten herkömmlichen Säule vorzuziehen. Damit wird nicht nur Zeit für eine Passivierung oder Konditionierung eingespart, sondern auch langanhaltend die Adsorption von Oligonukleotiden verhindert.

Die kürzlich eingeführten YMC-Accura Triart Säulen verfügen über ein neuartiges bioinertes Oberflächen-Coating des Säulenkörpers und der Fritten. Sie sind mit allen YMC-Triart Stationärphasen für die UHPLC (1.9 µm) und HPLC (3 und 5 µm) erhältlich. Die Handhabung bleibt dabei dieselbe wie mit konventioneller Hardware. Somit werden verlässlich stabile und exzellente Peaks mit hoher Sensitivität ab der ersten Injektion erlangt (s. Abb. 4). Um das bestmögliche Ergebnis zu erzielen, sollte ein bioinertes System verwendet werden. Auch wenn die Säule die größte Oberfläche im Flussweg darstellt, kann es auch außerhalb der Säule an Metallkomponenten zu einer Adsorption der Oligonukleotide kommen.

Literatur:

[1] J. Talap, J. Zhao, M. Shen, Z. Song, H. Zhou, Y. Kang, L. Sun, L. Yu, S. Zeng, S. Cai, Recent advances in therapeutic nucleic acids and their analytical methods, J. Pharm. Biomed. Anal. 206 (2021) 114368, doi: 10.1016/j.jpba.2021.114368 .

[2] K. Dhuri, C. Bechtold, E. Quijano, H. Pham, A. Gupta, A. Vikram, R. Bahal, Anti-sense oligonucleotides: an emerging area in drug discovery and development, J. Clin. Med. 9 (2020) 2004, doi: 10.3390/jcm9062004.

[3] A. Bateman-House, L. Kearns, Individualized therapeutics development for rare diseases: the current ethical landscape and policy responses, Nucleic Acid Ther. (2021), doi: 10.1089/nat.2021.0035.

[4] A. Goyon, P. Yehl, K. Zhang, Characterization of therapeutic oligonucleotides by liquid chromatography, J. Pharm. Biomed. Anal. 182 (2020) 113105, doi: 10. 1016/j.jpba.2020.113105.

[5] M. Gilar, K.J. Fountain, Y. Budman, U.D. Neue, K.R. Yardley, P.D. Rainville, R.J. Russell, J.C. Gebler, Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis of oligonucleotides, J. Chromatogr. A 958 (2002) 167–182, doi: 10.1016/S0 021-9673(02)0 0306-0.

[6] R.A. Mowery, The corrosion of 316 stainless steel in process liquid chromatography with acetonitrile or methanol carriers, J. Chromatogr. Sci. 23 (1985) 22– 29, doi: 10.1093/chromsci/23.1.22.

[7] D.R. Stoll, J.J. Hsiao, G.O. Staples, Troubleshooting LC separations of biomolecules, part I: background, and the meaning of inertness, LCGC N. Am. 38 (2020).

[8] G.J. Guimaraes, M.G. Bartlett, The critical role of mobile phase pH in the performance of oligonucleotide ion-pair liquid chromatography–mass spectrometry methods, Futur. Sci. OA. 7 (2021), doi: 10.2144/fsoa- 2021- 0084.

[9] K.T. Myint, T. Uehara, K. Aoshima, Y. Oda, Polar anionic metabolome analysis by nano-LC/MS with a metal chelating agent, Anal. Chem. 81 (2009) 7766–7772, doi: 10.1021/ac901269h

[10] M. Gilar, M. DeLano, F. Gritti, Mitigation of analyte loss on metal surfaces in liquid chromatography, J. Chromatogr. A 1650 (2021) 462247, doi: 10.1016/ j.chroma.2021.462247

[11] H. Lardeux, A. Goyon, K. Zhang, J.M. Nguyen, M.A. Lauber, D. Guillarme, V. D’Atri, The impact of low adsorption surfaces for the analysis of DNA and RNA oligonucleotides, J. Chromatogr. A 1677 (2022) 463324.

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