CHROMATOGRAPHIE Photodiodenarray - Detektion in der UPLC

Die Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) nutzt die Vorteile, die sich aus der Verwendung kleiner Partikel unter erhöhtem Arbeitsdruck ergeben. Sie ermöglicht chromatographische Trennungen mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit. Soll die UPLC ihr volles Potenzial entfalten, muss u.a. die Technologie der Photodiodenarray-(PDA)-Detektoren Schritt halten.

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Die Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) nutzt die Vorteile, die sich aus der Verwendung kleiner Partikel unter erhöhtem Arbeitsdruck ergeben. Sie ermöglicht chromatographische Trennungen mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit. Soll die UPLC ihr volles Potenzial entfalten, muss u.a. die Technologie der Photodiodenarray-(PDA)-Detektoren Schritt halten.

Das erste LC-System, das für Arbeitsdrücke bis 1000 bar ausgelegt war, wurde 2004 vorgestellt [1-6]. Verbesserungen in der Auflösung (bis Faktor 1,7), der Empfindlichkeit (bis Faktor drei) und der Analysengeschwindigkeit (bis Faktor neun) konnten für zahlreiche Applikationen demonstriert werden [3, 4]. Die neuartige Kombination aus einer für hohe Arbeitsdrücke geeigneten Hardware und mit kleinen Partikeln (1,7 µm) gepackten Säulen erhielt zur Unterscheidung von der klassischen High Performance Liquid Chromatography (HPLC) die Bezeichnung Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC [3]). Eine hohe Empfindlichkeit und eine geringe Bandenverbreiterung müssen bei der UPLC - genau wie bei jeder anderen FlüssigChromatographie-Methode - ebenso wie der schnelle Zugriff auf die reichhaltigen, spektralen Informationen, gewährleistet sein. Der vorliegende Artikel beschreibt eine neue PDA-Technologie, die speziell für hochauflösende Hochgeschwindigkeitstrennungen auf dem Waters Acquity UPLC System entwickelt wurde. Alle genannten Vorteile hängen unmittelbar mit den in den UPLC-Säulen verwendeten 1,7 µm Partikeln zusammen.

Die PDA-Detektion wird in Labors allgemein zur Bestimmung der Peak-Identität und des Reinheitsgrades bzw. der Homogenität eingesetzt. Moderne Detektorhardware, die eine Auflösung von 1,2 nm erreicht, liefert eine spektrale Feinstruktur, die mittels mathematischer Software-Algorithmen spektrale Unterschiede zwischen Verbindungen mit sehr ähnlicher Struktur enthüllen kann. Spektrale Informationen dieser Art lassen sich für die Peak-Identifizierung und die Suche nach co-eluierenden Komponenten in der Methodenentwicklung nutzen. Selbiges gilt für die Identifizierung verwandter Verbindungen in Verunreinigungsprofilen. Die spektralen Daten bleiben gleichzeitig für quantitative Routineanalysen bei nur einer Wellenlänge nutzbar.

Mit der Ausarbeitung sehr schneller UPLC-Applikationen wurde die Entwicklung einer neuen Detektortechnologie erforderlich, die mit den Möglichkeiten der UPLC Schritt halten kann. Der traditionellen PDA-Detektortechnologie fehlt es an der nun erforderlichen Empfindlichkeit. Zudem verursacht die höhere Bandenverbreiterung Einbußen bei der Auflösung. Um die Vorteile der PDA-Detektion mit der UPLC voll ausschöpfen zu können, ist neben höheren Datenraten ein neues Design der Detektorzelle erforderlich, das keinen relevanten Beitrag zur Bandenverbreiterung des Systems leistet. Wir beschreiben nachstehend die zur effizienten Nutzung der PDA-Detektion mit der UPLC notwendigen technologischen Verbesserungen.

Detektorzellentechnologie

Konventionelle absorptionsbasierende, optische Detektoren sind konzentrationsempfindliche Detektoren. Die kleinvolumigen Peaks, die Acquity UPLC-Säulen mit ihrem geringen Durchmesser und ihrer hohen Kapazität produzieren, machen es erforderlich, dass auch das Flusszellenvolumen des UPLC-Detektors entsprechend gering ist. Konventionelle Flusszellen mit kleinem Volumen verkürzen gemäß dem Beerschem Gesetz die Weglänge, die für die Signalstärke von wesentlicher Bedeutung ist. Eine Reduzierung des Querschnitts bedeutet eine Verkürzung des Lichtweges und verursacht Transmissionsverluste, die das Rauschen verstärken. Eine konventionelle HPLC-Flusszelle beeinträchtigt daher die Empfindlichkeit der UPLC. Zur Minimierung der Systembandenverbreiterung und zur Erhaltung von Konzentration und Empfindlichkeit wurde eine kleinvolumige lichtführende Flusszelle entwickelt, bei der es sich im Prinzip um eine optische Faser mit flüssigem Kern handelt (s. Abb.1).

In der für optimale Weglänge und hohen Lichtdurchsatz konzipierten Zelle kommt Teflon AF zum Einsatz. Die nach innen reflektierende Oberfläche verbessert die Lichttransmission durch Vermeidung von Absorptionsverlusten. Das Licht wird über einen internen Reflexionsmodus effizient durch die Flusszelle geführt, was bei einem Zellvolumen von nur 500 nL eine Weglänge von 10 mm garantiert. Die lichtführende Flusszelle bietet ein außerordentlich gutes Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht damit die Nutzung des Acquity UPLC Systems beispielsweise zur Bestimmung von Verunreinigungen im Spurenbereich (s. Abb. 2). Der Acquity UPLC PDA-Detektor erlaubt die Quantifizierung von Verunreinigungen im Konzentrationsbereich von 0,0004 Prozent.

Die Kombination von geringem Rauschen, breitem linearen Bereich und hervorragender spektraler Auflösung bei hohen und niedrigen Signalstärken ist eine weitere Voraussetzung für die hochempfindliche Spurenanalyse. Abbildung 3 präsentiert ein typisches Verunreinigungsprofil. Der aktive Inhaltsstoff Prilocain zeigt eine Absorption von 1,6 AU, die 0,01-prozentige bekannte Verunreinigung o-Toluidin eine von 0,002 AU. Beide lassen sich in einer einzigen Analyse mit hervorragender spektraler Auflösung quantifizieren, sodass Zeit gespart und die Methode gleichzeitig robuster gemacht werden kann. Abbildung 4 verdeutlicht die Linearität sowohl des aktiven Inhaltsstoffs als auch der 0,01 prozentigen Verunreinigung.

Datenrate und Filterkonstanten

Mit 1,7 µm Partikeln lassen sich Peak-Breiten in halber Höhe von weniger als einer Sekunde erzielen, was für den Detektor eine erhebliche Herausforderung darstellt. Zur präzisen und reproduzierbaren Integration eines Peaks muss die Abtastrate des Detektors derart hoch sein, dass sie eine ausreichende Zahl von Datenpunkten über den Peak hinweg liefert (für eine reproduzierbare Quantifizierung in der Regel 25 bis 50). Typische Detektoren bieten eine Basisdatenrate, die meist mit der höchsten verfügbaren Datenrate identisch ist. Möchte man eine geringere Datenrate erhalten, werden Datenpunkte gemittelt. Im Falle einer Basisdatenrate von beispielsweise 20 Hz werden für eine Rate von 10 Hz stets zwei Datenpunkte gemittelt, für eine Rate von 5 Hz stets vier Datenpunkte usw. Die resultierenden „gefilterten“ Daten weisen ein geringeres Rauschniveau und niedrigere Datenraten auf.

Die Filterung ist jedoch gegenüber der Notwendigkeit abzuwägen, genügend Datenpunkte zur adäquaten Quantifizierung des interessierenden Peaks zu sammeln. Selbiges gilt gegenüber dem gewünschten Signal-Rausch-Verhältnis bzw. der angestrebten Empfindlichkeit. Aus diesem Grunde ist eine unabhängige Optimierung erforderlich (s. Abb 5). Im Allgemeinen entspricht die beste Filterkonstante dem Kehrwert der Datenrate. Wird eine höhere Empfindlichkeit gewünscht oder die Integration durch das Grundlinienrauschen gestört, sollte die Filterkonstante erhöht werden. Ist die Auflösung beeinträchtigt, sollte sie vermindert werden.

Detektion und Methodenübertragung

Der PDA-Detektor ist ein wertvolles Hilfsmittel in der Methodenentwicklung. Eine der Stärken der PDA-Detektion ist die Peak-Identifizierung während der Methodenentwicklung oder der Methodenübertragung von der HPLC auf die UPLC (s. Abb. 6).

Dieser Methodentransfer kann Veränderungen in der Selektivität mit sich bringen. Bei korrekter Konfiguration lassen sich spektrale Abgleichalgorithmen verwenden, die die Auswirkung von Selektivitätsänderungen auf das Retentionsverhalten verfolgen. Auf diese Weise lässt sich Zeit sparen, die andernfalls für individuelle Injektionen aufzuwenden wäre.

Zusammenfassung

Der Acquity UPLC PDA-Detektor wurde speziell als Ergänzung des Acquity UPLC-Kernsystems konzipiert. Die neue Flusszelle und die neue Elektronik bieten eine höhere Empfindlichkeit und eine größere Linearität. Beides verbessert die Qualität der chromatographischen und spektralen Informationen, die Analytiker in der Spurenanalyse (Stability-Indicating-Assays, Verunreinigungsprofile) und der quantitativen Routineanalytik benötigen.

*Dr. M. E. Swartz, B. Hazell, Waters Corporation, Milford/USA**Dr. D. Sievers, Waters GmbH, 65760 Eschborn

Literatur:[1] Swartz, M. E. und Sievers, D. Labo, März 2005, S. 14-19.[2] Swartz, M.E. und Thomas, C., LaborPraxis, März 2005, S. 38-41.[3] Swartz, M.E. in Ultra Performance LC: Separation Science Re-Defined, LCGC Supplement, Mai 2005, S. 14.[4] Swartz, M.E., American Laboratory, Vol. 37 (3), Februar 2005, S. 22.[5] Swartz, M.E. und Murphy, B., J. Liq. Chrom. and Related Tech., Vol. 28, 2005, S. 1253.[6] Mazzeo, J.R., Neue, U.D., Kele, M. und Plumb, R. S., Analytical Chemistry, Dezember 2005, S. 460A-467A.

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