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Aussagekräftige Aerosole Polysaccharide per Gasphasenelektrophorese charakterisieren

Ein Gastbeitrag von Prof. Dr. Victor U. Weiss und Prof. Dr. Günter Allmaier*

Ein System für die Gasphasenelektrophorese ermöglicht die Charakterisierung von (Bio-) Nanopartikeln wie Polysacchariden hinsichtlich ihrer Größe und Größenverteilung, der Partikelzahlen, Probenzusammensetzung und des Molekulargewichts der untersuchten Analyten – ein „Rundumschlag“ für die (Bio-) Nanopartikelforschung also.

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Die Verbindungsklasse der Polysaccharide – Mehrfachzucker – ist äußerst divers, ihre Charakterisierung eine analytische Herausforderung.
Die Verbindungsklasse der Polysaccharide – Mehrfachzucker – ist äußerst divers, ihre Charakterisierung eine analytische Herausforderung.
(Bild: gemeinfrei / Pixabay )

Polysaccharid ist mitnichten gleich Polysaccharid – so viel dürfte klar sein. Doch was ist ein Polysaccharid und wie lässt es sich von anderen Mehrfachzuckern unterscheiden? Tatsächlich stellt die Charakterisierung dieser Verbindungsklasse aufgrund möglicher, unterschiedlicher einzelner Zuckermonomere sowie unterschiedlicher intramolekularer Verknüpfungs- und Verzweigungsmöglichkeiten eine analytische Herausforderung dar.

Innerhalb der Klasse der Polysaccharide sind Homopolysaccharide nur aus einer Monomereinheit aufgebaut. Ihr Aufbau ist somit bereits weniger komplex als jener von Heteropolysacchariden. Dextrane als Vertreter der Homopolysaccharide bestehen beispielsweise nur aus Glucoseeinheiten, welche jedoch auf zwei verschiedene Arten miteinander verknüpft und dadurch verzweigt vorliegen können. Unterschiedliche Polymerlängen und Verknüpfungen ergeben daher auch im Falle dieses Homopolysaccharids eine polydisperse, natürliche Analytmischung, deren Charakterisierung zumeist aufwändig ist.

Abb. 1: nES GEMMA Gesamtsystem (A). GEMMA-Messungen ermöglichen die Bestimmung der Größe – symbolisch via Schublehre (B) und der Größenverteilung von Polysacchariden. Basierend auf diesen Daten können letztlich auch Molekulargewichtsverteilungen – symbolisch via Waage (C) ermittelt werden.
Abb. 1: nES GEMMA Gesamtsystem (A). GEMMA-Messungen ermöglichen die Bestimmung der Größe – symbolisch via Schublehre (B) und der Größenverteilung von Polysacchariden. Basierend auf diesen Daten können letztlich auch Molekulargewichtsverteilungen – symbolisch via Waage (C) ermittelt werden.
(Bild: TU Wien)

Die Gasphasenelektrophorese, wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt, bietet in diesem Zusammenhang eine sehr interessante Alternative zu gängigen Charakterisierungsmethoden dar. Neben Nano­partikelgrößenverteilungen können auch Molekulargewichtsverteilungen aus Daten der Gasphasenelek­trophorese abgeleitet werden.

Elektrophorese in der Gasphase

Gasphasenelektrophorese auf einem nES-GEMMA(nano Electro­spray Gas-phase Electrophoretic Mobility Molecular Analyzer)-In­strument, welches oft auch als nES DMA (nano Electrospray Differential Mobility Analyzer) bezeichnet wird, ermöglicht die Trennung von einfach geladenen Partikeln im Nanometermaßstab bei Umgebungsdruck nur nach der Partikelgröße. Abbildung 2 zeigt eine entsprechende schematische Darstellung des Geräteaufbaus.

Abb. 2: Schematische Abbildung und Funktionsweise eines nES GEMMA Instruments bestehend aus einer Nano-Elektrospray-Ladungsreduktions-Einheit, einem DMA – dem Trennteil –, und einem universellen Kondensationspartikel-Detektor.
Abb. 2: Schematische Abbildung und Funktionsweise eines nES GEMMA Instruments bestehend aus einer Nano-Elektrospray-Ladungsreduktions-Einheit, einem DMA – dem Trennteil –, und einem universellen Kondensationspartikel-Detektor.
(Bild: TU Wien)

Im Zuge einer Analyse werden (Bio-) Nanopartikel zunächst aus einer flüchtigen Elektrolytlösung, beispielsweise Ammoniumacetat, mittels einer Kapillare durch Anlegen von Druck und einem elektrischen Feld versprüht. Die dadurch erhaltenen Tröpfchen sind mehrfach geladen und werden in weiterer Folge in einem partikelfreien Gasgemisch aus komprimierter Raumluft und Kohlendioxid getrocknet. Gleichzeit findet auch eine Ladungsreduktion innerhalb einer bipolaren Atmosphäre statt, sodass – vereinfacht gesagt – bereits nach einer kurzen Strecke in der Gasphase oberflächengetrocknete, einfach geladene Analytpartikel vorliegen. Diese sind jedoch gemäß ihrer Verteilung in der flüssigen Phase polydispers.

In einem nächsten Schritt gelangen diese Aerosole nun in einen DMA. Dort wirken zwei Kräfte auf die Analytteilchen. Zum einen werden sie durch einen konstanten, hohen und partikelfreien Luftstrom durch den DMA getragen, zum anderen wirkt ein elektrisches Feld im rechten Winkel auf die Teilchen ein. Wird nun die Stärke dieses Feldes mit der Zeit verändert, so können nach elektrophoretischen Prinzipien einfach geladene Teilchen nur in Abhängigkeit ihrer Größe (elek­trophoretischer Mobilitätsdurch­messer, EMD) unterschiedlich stark abgelenkt werden. Dadurch kommt es zu einer Größenauftrennung. Schlussendlich verlassen diese monodispersen Nanopartikel dann den DMA bei einer ihrer Größe entsprechenden Feldstärke.

Die abschließende Detektion der Partikel erfolgt nach einem Kondensationsschritt in einer übersättigten Atmosphäre von n-Butanol oder Wasser durch Erfassen der entsprechenden Partikelzahlen mittels Laserlichtstreuung. Man erhält ein Spektrum, in welchem Partikelzahlen den entsprechenden, oberflächentrockenen EMD-Werten gegenübergestellt werden. Kleinere Probenbestandteile können somit neben größeren, in Bezug auf EMD, detektiert werden.

Somit eignet sich nES GEMMA hervorragend zur Größenbestimmung von polydispersen Analyten, selbst in Mischungen von (Bio-) Polymeren, solange eine Trennung der einzelnen Komponenten erzielt werden kann. Neben Informationen zu Partikelgröße und Analytheterogenität können auch Informationen zu Partikelzahlen und zur Probenzusammensetzung gewonnen werden.

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Vom EMD zum Molekular­gewicht von Analyten

In Folge kann die Korrelation des EMD mit dem Molekulargewicht (MW) eines Analyten erfolgen. Letztlich, und dies wurde bereits 2001 für Proteine gezeigt, lässt sich das MW eines (Bio-) Nanopartikels somit aus seinem EMD ableiten. Ein entsprechender Ansatz wurde nun auch für verschiedene Polysaccharide gewählt. Abbildung 3 zeigt zunächst beispielhafte Spektren von Dextranen mit unterschiedlichem, vom Hersteller zertifizierten MW. Im Gegensatz zu monodispersen Proteinen liefern Dextrane aufgrund variierender Polymerlängen und Monomerverknüpfungsmöglichkeiten breitere Peaks. Durch Peakfitting lassen sich jedoch auch in diesem Fall EMD-Werte ermitteln.

Abb. 3: GEMMA-Beispielspektren von Dextranen mit unterschiedlichem, durchschnittlichem MW (links, laut Herstellerangaben) sowie die ermittelte EMD/MW-Korrelation.
Abb. 3: GEMMA-Beispielspektren von Dextranen mit unterschiedlichem, durchschnittlichem MW (links, laut Herstellerangaben) sowie die ermittelte EMD/MW-Korrelation.
(Bild: TU Wien)

Basierend auf zur Verfügung gestellten MW-Werten sowie experimentell ermittelter EMD-Daten konnte letztlich eine EMD/MW-Korrelation für Dextrane erstellt werden. Interessanterweise zeigt diese Korrelation eine signifikante Abweichung von dem zuvor genannten Proteinfall, möglicherweise aufgrund unterschiedlicher Analytkonformationen in der Gasphase. Aus diesem Grund ist eine gewisse grundlegende Kenntnis zum vorliegenden (Bio-) Nanopartikel notwendig, um letztendlich nES-GEMMA-basierte MW-Bestimmungen durchführen zu können.

Vorteile des nES GEMMA basierten Weges...

Gasphasenelektrophorese stellt einen schnellen und kostengünstigen Weg dar, um über einen weiten Nanopartikeldurchmesser- (von einigen wenigen bis hin zu einigen hundert nm EMD) und somit MW-Bereich (Bio-) Nanopartikel zu charakterisieren. Zusätzlich zu Informationen betreffend Partikelgröße und MW resultieren echte partikelzahlenbasierte Konzentrationen, wie es eine EU-Richtlinie empfiehlt.

... und entsprechende Nachteile

Elektrospraybasierte Methoden sind empfindlich hinsichtlich der versprühten Analytkonzetrationen. Sind diese zu hoch, werden unspezifische Aggregate von erhöhtem EMD detektiert und somit ein systematischer Fehler in die erhaltenen Daten eingebracht. Für Polysaccharide ist dies umso problematischer, da breite Analytverteilungen bereits natürlich vorliegen. Zudem ist keine Unterscheidung zwischen Monomer-, Dimer- und Multimereinheiten möglich, anders als bei Proteinen. Dies lässt sich jedoch sehr gut durch Messung der Proben bei unterschiedlichen Verdünnungen überprüfen. Nur für konstanten EMD bei Proben unterschiedlicher Konzentration kann von unspezifischer Aggregation während des Elektrosprayprozesses Abstand genommen werden.

Was zum Schluss zu sagen bleibt

Letztendlich ermöglicht nES GEMMA die Charakterisierung von (Bio-) Nanopartikeln hinsichtlich derren Größe und Größenverteilung, der Partikelzahlen, Probenzusammensetzung und des MW der untersuchten Analyten und stellt somit eine exzellente Methode in der (Bio-) Nanopartikelforschung dar.

Literatur:

Weiss et al.: Size and molecular weight determination of polysaccharides by means of nano electrospray gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis (nES GEMMA). Electrophoresis. 2018 May;39(9-10):1142-1150. doi: 10.1002/elps.201700382. Epub 2018 Mar 25.

* Prof. Dr. V. U. Weiss, Prof. Dr. G. Allmaier, TU Wien, Institut für Chemische Technologien und Analytik, 1060 Wien, Österreich

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