Ultrazentrifugation Ultrazentrifugation – Einsatzmöglichkeiten und Hindernisse

Eine Ultrazentrifuge kann Kräfte entfalten, die tausend- oder millionenfach höher sind als die Schwerkraft. Außerdem haben sich Ultrazentrifugen in vielen Anwendungsbereichen der wissenschaftlichen Forschung als außerordentlich wertvolle Laborinstrumente bewährt. Lesen Sie hier u.a., welche Kombination von Rotor und Probenröhrchen bei der Ultrazentrifugation die besten Ergebnisse liefern.

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Ultrazentrifugen sind gerade aus der biologischen Probenvorbereitung nicht mehr wegzudenken. Mit Geschwindigkeiten von bis zu 150 000 Umdrehungen pro Minute (U/min) bei der Partikeltrennung und einer relativen Zentrifugalbeschleunigung (RZB) von über 1 000 000 x g ist die Ultrazentrifugation eine ideale Technik für die Zellbiologie (subzelluläre Fraktionierung), Proteomik (Reinigung und Fraktionierung von Proteinen und Lipoproteinen), Genomik (RNA- und DNA-Reinigung), Mikrobiologie (Pelletierung und Virusreinigung/-konzentration) aber auch in der Nanotechnologie zur Reinigung und Trennung von Nanopartikeln.

Analytisch oder präparativ?

Die Ultrazentrifugation kann sowohl für analytische als auch für präparative Zwecke eingesetzt werden.

Die analytische Ultrazentrifugation wird in der Regel zur Bestimmung von Sedimentationskoeffizienten und Molekülgewichten eingesetzt. Die Probenbestandteile werden bei dieser Methode nach ihrer Dichte getrennt. Die analytische Ultrazentrifugation liefert Informationen über Form, Konformationsänderung und Größenverteilung von Makromolekülen.

Doch auch größere Probenvolumina können bearbeitet werden: Zu den biologischen Anwendungsgebieten der präparativen Ultrazentrifugation gehört die Pelletierung von Feinpartikelfraktionen wie Zellorganellen und Viren. Darüber hinaus eignen sich präparative Zentrifugen auch für die Gradiententrennung. Zur Trennung von Organellen werden in der Regel Saccharosegradienten, zur Trennung von Nukleinsäuren Cäsiumsalzgradienten verwendet.

Theoretische Grundlagen

Die entscheidenden Faktoren bei der Ultrazentrifugation sind die Größe und Dichte des Ausgangsmaterials. Davon hängt es ab, ob eine differenzielle Zentrifugation oder eine Dichtegradientenzentrifugation angewandt wird.

Die differenzielle Zentrifugation ist eine Methode zur Pelletierung von Partikeln mit abnehmender Sedimentationsgeschwindigkeit, wobei Geschwindkeit und Dauer der Zentrifugation bei jedem Durchlauf gesteigert werden. Bei der Trennung von Zellmaterial setzen sich größere und dichtere Komponenten, beispielsweise der Zellkern oder der Golgi-Apparat, am schnellsten ab und bilden am Boden des Röhrchens ein Pellet. Kleinere Komponenten mit geringerer Dichte, wie mikrosomale Vesikel und Lysosomen, bleiben dagegen in Suspension (Überstand).

Die Dichtegradientenzentrifugation ist eine Methode der Partikeltrennung, die sich die unterschiedlichen Sedimentationsgeschwindigkeiten der Komponenten zunutze macht. Diese kommen auf unterschiedlichen Höhen im Röhrchen zum Stillstand, nachdem sie ein Dichtegleichgewicht mit dem Lösemittel des umgebenden Milieus erreicht haben. Es gibt zwei Arten der Dichtegradientenzentrifugation: Zonenzentrifugation und isopyknische Zentrifugation. Bei der Zonenzentrifugation werden die Partikel nach Molekülgewicht getrennt. Dazu wird die Probe als Überschicht auf eine gebrauchsfertige Lösung mit Gradientenbildner, z.B. Saccharose, aufgebracht. Zum Boden des Röhrchens hin wird die Dichte der Probe immer größer, wobei die Partikel je nach ihrem Sedimentationswert isolierte Banden bilden. Diese Art der Zentrifugation stellt eine effektive Methode zur Trennung von Proteinen, DNA, ribosomalen Untereinheiten oder Polysomen dar.

Die isopyknische Zentrifugation ist eine Gleichgewichtszentrifugation, bei der die Partikel nach Dichte getrennt werden. Vor der Zentrifugation wird die Probe mit einem Gradientenbildner (Cäsiumchlorid, CsCl) vermischt, der bei der Zentrifugation einen Dichtegradienten erzeugt. Die Partikel in der Probe wandern je nach Dichte zum entsprechenden isopyknischen Punkt des Gradientenmaterials. Diese Art der Zentrifugation eignet sich für die Trennung unterschiedlicher DNA-Typen (zirkulär, linear, Doppelstrang, Einzelstrang usw.), für die Trennung von DNA und RNA sowie für die Trennung von Lipoproteinen und Zellorganellen.

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