Vitamin D in Serum effizient und sicher bestimmen

Anbieter zum Thema

Gerstel GmbH & Co. KG

Axel Semrau GmbH /Trajan Scientific and Medical

Labexchange - Die Laborgerätebörse GmbH

Herausforderung: Vitamin-D-Spiegel-Bestimmung

Einen vollständigen Überblick über die im Blut zirkulierende Menge an Vitamin D liefert indes, und zwar aufgrund der Aufnahme von Vitamin-D2-haltiger Lebensmittel, Präparate und Nahrungsergänzungsmittel, die Analyse beider 25-OH-Derivate. „Für die Quantifizierung von 25-OH-D3 und 25-OH-D2 hat sich die Hochleistungsflüssigchromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektroskopie (HPLC-MS/MS) als Mittel der Wahl herausgestellt “, berichtet Paul H. Roberts von der Anatune Ltd. in England. Mit Unterstützung des University Hospitals of Leicester hat Roberts eine LC-MS/MS-Methode auf Basis der automatisierten Festphasenextraktion (SPE) entwickelt, mit der sich beide Stoffe sicher und effizient in Serumproben in einem Lauf bestimmen lassen. „Wesentlich für den Erfolg der Methode ist der Einsatz eines flexiblen Autosamplers sowie einer Steuersoftware, die es ermöglicht, den Vorgaben der Laboratorien an die Automatisierung der Analyse, einschließlich eines hohen Probendurchsatzes und der Kostenminimierung Rechnung zu tragen“, weiß Roberts: Anatune gehört in Großbritannien zu den führenden Anbietern von automatisierten Komplettlösungen für die LC/MS und GC/MS. Resultat seiner Bemühungen war eine „Ein-Knopfdruck-Messmethode“ zur quantitativen Bestimmung von 25-OH-D3 und 25-OH-D2“.

Technische Ausstattung und Messmethode

Um den Vorgaben der effizienten Routineanalytik zu entsprechen, setzte Roberts die sogenannte Dualrail-Variante des Multi Purpose Samplers von Gerstel (MPS, MPS-Prep-Station) ein, der zwei unabhängig voneinander, in alle Raumrichtungen agierende Robotertürme zur automatisierten Probenvorbereitung und Probenaufgabe besitzt: Während der eine Turm mit einer vergleichsweise großvolumigen Flüssigspritze für die Durchführung der SPE ausgestattet ist, trägt der andere Turm eine Mikroliterspritze für die Injektion geeigneter kleiner Probenvolumina in das HPLC-System. Darüber hinaus verfügt die MPS-Prep-Station im vorliegenden Fall über die Einbindung einer Zentrifuge. Getrennt und detektiert wurden die Proben auf einem Agilent-1200-Serie-HPLC verbunden mit dem „Agilent 6410 Triple Quadrupol Mass Spectromter with HotBox and Multimode Source“.

Zur Kalibrierung des Systems verwendete Roberts eine kommerziell erhältliche 25-OH-D2/D3-Lösung, von der er eine Verdünnungsreihe erstellte.

200 µL Serum wurden in 2-mL-Standardvials gegeben, verschlossen und manuell auf ihre Position auf dem Probenteller der MPS-Prep-Station gesetzt. Alle weiteren Arbeitsschritte der Analyse erfolgten voll automatisiert und wurden von der zuvor programmierten Gerstel-Maestro-Software gesteuert.

Die Trennung wurde auf einer Agilent-Trennsäule Eclipse C18 (2,1 x 50 mm mit 3,5 µm Partikelgröße) vorgenommen. Die mobile Phase bestand aus 0,1-prozentiger Essigsäure (v/v) in Wasser (Eluent A) und 0,1-prozentiger Essigsäure in Methanol (Eluent B). Eine Gradientenelution erfolgte von 20 Prozent B innerhalb von zwei Minuten nach 90 Prozent B (30 Sekunden). Die Säule wurde anschließend wieder auf Startbedingungen equilibriert. Der Säulenfluss betrug konstant 0,5 mL/min bei einer Säulentemperatur von 50 °C. Die Detektion der Analyte erfolgte im ESI/APCI-Modus. Die Analyse einer Probe dauerte 5,5 Minuten, wobei sich die Effizienz durch Verschachtelung von Probenvorbereitung und Analyse maximieren ließ.

Dazu noch einmal HPLC-Experte Roberts: „Die Korrelationskoeffizienten der Kalibriergeraden der Zielanalyten 25-OH-D2 und 25-OH-D3 lagen bei 0,999 beziehungsweise 0,997. Die Validierung der Methode erfolgte durch die UTAK Laboratories mittels der Analyse von Vitamin-D3-Serum-Kontrollproben.“ Wichtig für Roberts war auch, dass die mit der MPS-Prep-Station erstellten Extrakte frei von störenden Matrixbestandteilen waren, sodass die Wissenschaftler Chromatogramme erhielten, in denen die Zielanalyten 25-OH-D2 und 25-OH-D3 sauber und deutlich zu erkennen und auszuwerten waren.

*G. Deußing, Science Communication, 41464 Neuss

(ID:353154)