Mikroskopische Schärfentiefe Wie scharfe Bilder entstehen

Schärfentiefe ist in der Mikroskopie eine oft empirisch verstandene Messgröße. In der Praxis bestimmen die Zusammenhänge zwischen numerischer Apertur, Auflösung und Vergrößerung diesen Parameter. Moderne Mikroskope erzeugen mit ihren Einstellmöglichkeiten eine für den visuellen Eindruck optimale Balance zwischen Schärfentiefe und Auflösung – zwei Parameter, die sich prinzipiell gegenläufig verhalten.

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In DIN/ISO-Normen wird die objektseitige Schärfentiefe definiert als „Axiale Tiefe des Raums beidseitig der Objektebene, in dem das Objekt ohne nachweisbaren Schärfeverlust bewegt werden kann, während die Positionen von Bildebene und Objektiv unverändert bleiben“. Dazu, wie die Nachweisgrenze des Schärfeverlustes ermittelt werden sollte, liefert die Norm allerdings keinen Hinweis. Die älteste Publikation zur visuell empfundenen Schärfentiefe stammt von Max Berek. Bereits 1927 hat er die Resultate seiner umfangreichen Versuche veröffentlicht. Für die visuelle Schärfentiefe liefert die Bereksche Formel praxistaugliche Werte und wird deshalb auch heute noch angewendet. In vereinfachter Form lautet sie:

TVIS = n [lambda/(2·NA2) + 340 μm/(NA·MTOT VIS)]

TVIS: visuell empfundene Schärfentiefe

N: Brechungsindex des Mediums, in dem sich das Objekt befindet. Wird das Objekt bewegt, ist der Brechungsindex des Mediums einzusetzen, das den sich verändernden Arbeitsabstand bildet.

Lambda: Wellenlänge des benutzten Lichts, bei Weißlicht ist lambda = 0.55 μm

NA: objektseitige numerische Apertur

MTOT VIS: visuelle Gesamtvergrößerung des Mikroskops

Ersetzt man in der obigen Gleichung die visuelle Gesamtvergrößerung durch die Beziehung der förderlichen Vergrößerung (MTOT VIS = 500 bis 1000·NA), wird deutlich, dass sich die Schärfentiefe in erster Näherung umgekehrt proportional zur numerischen Apertur im Quadrat verhält (s. Abb. 1).

Balance zwischen Auflösung und Schärfentiefe

Insbesondere bei niedrigen Vergrößerungen lässt sich die Schärfentiefe durch Abblenden, das heißt durch Verkleinern der numerischen Apertur, stark erhöhen. Dies erfolgt üblicherweise mit der Aperturblende bzw. einer Blende, die auf einer konjugierten Ebene zu dieser liegt. Mit geringer werdender numerischer Apertur nimmt aber auch die laterale Auflösung ab.

Es gilt je nach Objektstruktur die optimale Balance zwischen Auflösung und Schärfentiefe zu finden. Moderne Lichtmikroskope erlauben mit hochauflösenden Objektiven (hohe NA) und einstellbaren Aperturblenden eine flexible Abstimmung auf die jeweilige Anforderung der Probe. Bei Stereomikroskopen muss häufig ein Kompromiss zugunsten der höheren Schärfentiefe eingegangen werden, da die z-Ausdehnung dreidimensionaler Strukturen dies oft erfordert.

Noch mehr Schärfentiefe

Ein optischer Ansatz von Leica Microsystems, die bei Stereomikroskopen den Zusammenhang zwischen lateraler Auflösung und Schärfentiefe aushebelt, ist FusionOptics. Hier liefert ein Strahlengang einem Auge des Beobachters ein Bild hoher Auflösung und geringer Schärfentiefe. Über den zweiten Strahlengang sieht das andere Auge ein Bild des gleichen Objekts mit geringer Auflösung und hoher Schärfentiefe. Das menschliche Hirn fusioniert die beiden Einzelbilder zu einem optimalen Gesamtbild mit sowohl hoher Auflösung als auch hoher Schärfentiefe.

Ein weiteres Beispiel, das die phänomenale Leistung des menschlichen Hirns illustriert, ist das Stereomikroskop nach Greenough. Hier sind die Objektebenen des linken und rechten Strahlenganges leicht gegeneinander geneigt (s. Abb. 2). Im Gesamtbild erscheint der ganze schraffierte Bereich scharf, obwohl dies weder im linken, noch im rechten Teilbild der Fall ist.

Schärfentiefe in der digitalen Bildverarbeitung

Das Modul Multifokus der Leica Application Suite wurde entwickelt, um die Tiefenschärfe des automatisierten Mikroskops um ein Vielfaches auszuweiten. Belichtung, Bildhelligkeit und alle anderen Kameraparameter können individuell eingestellt werden, um die Qualität des daraus resultierenden Bildes zu optimieren.

Das LAS Multifokus-Modul erfasst auf einfache Weise die erweiterte Tiefenschärfe von Live-Bildern durch vollintegrierte Mikroskopsteuerung mit Motorfokus. Die automatische Erfassung von Bildstapeln (Z-Stack) in Kombination mit den intelligenten Bildkombinationsalgorithmen garantiert eine einfache Aufnahme und Speicherung von scharfen Bildern. Durch die automatisierte Verarbeitung muss der Benutzer kaum eingreifen. Die Einstellungen können einfach umgeändert werden, um mit einer breiten Palette von Proben zu arbeiten. Das Multifokus-Model eignet sich für Anwendungen in der Werkstoffkunde, Gerichtsmedizin sowie in Bio- und Geowissenschaften.

* R. Rottermann, P. Bauer und A. Schué, Leica Microsystems, 35578 Wetzlar

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