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Einfluss der Temperatur auf die Selektivität

HPLC: Vier Substanzen = vier Peaks?

| Autor / Redakteur: Frank Steiner* & Katherine Lovejoy* / Marc Platthaus

Abb.1: Van’t Hoff Plot gemäß Gleichung 1 zur Trennung von 4 Konservierungsstoffen auf einer Thermo Scientific Acclaim RSLC Polar Advantage II Säule, betrieben mit einer 50/50 Mischung von wässriger 20 mM Natriumphosphat Lösung bei pH=7, und MeOH als mobiler Phase. Die Abbildung zeigt unten rechts die unzulängliche Trennung bei der sehr gebräuchlichen Temperatur von 40 °C, sowie in der Legende die Strukturformeln der Analyte.
Abb.1: Van’t Hoff Plot gemäß Gleichung 1 zur Trennung von 4 Konservierungsstoffen auf einer Thermo Scientific Acclaim RSLC Polar Advantage II Säule, betrieben mit einer 50/50 Mischung von wässriger 20 mM Natriumphosphat Lösung bei pH=7, und MeOH als mobiler Phase. Die Abbildung zeigt unten rechts die unzulängliche Trennung bei der sehr gebräuchlichen Temperatur von 40 °C, sowie in der Legende die Strukturformeln der Analyte. (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Erhöht man bei der HPLC die Temperatur, so wirkt sich dies auf verschiedene Parameter aus. An der Trennung von vier Konservierungsstoffen wird gezeigt, warum der Anwender nicht nur die Geschwindigkeit im Blick haben sollte, sondern auch die Selektivitäten der Analyten.

Die Thermostatisierung der Trennsäule wird zwar bei nahezu allen modernen und automatisierten HPLC-Geräten vorgenommen, dennoch steht die Säulentemperatur meist nicht als wichtiger Parameter im Fokus der Methodenentwicklung. In erster Linie wird die Temperaturerhöhung in der Praxis als ein Weg zur Senkung der Viskosität der mobilen Phase gesehen. Primäres Ziel ist es dabei, den Rückdruck der Säule bei einer bestimmten Flussrate zu senken. So eignet sich eine Erhöhung der Säulentemperatur dazu, die Kinetik in der HPLC zu beschleunigen. Das Prinzip ist, mit einer Erhöhung der Flussrate Trennungen schneller zu machen, dabei aber durch die geringere Viskosität stets bei moderatem Rückdruck der Säule zu bleiben.

Die Temperatur beeinflusst bekanntlich jedoch nicht nur die Geschwindigkeit von Prozessen, sondern auch die Lage von Gleichgewichten und somit in der Chromatographie auch die Retention von Substanzen. Dies kann durchaus in bestimmten Trennmethoden auch zu temperaturabhängigen Selektivitäten für verschiedene Analyte führen. Ein besonders prägnanter Fall soll hier grundlegend betrachtet werden.

Prinzipiell beschreibt die van’t Hoff’sche Gleichung die Lage von Gleichgewichten und so lässt sich mit ihr gemäß Gleichung 1 der Retentionsfaktor k in Abhängigkeit von der Temperatur der Trennsäule beschreiben, wobei ΔH0 die Übergangsenthalpie des Analyten zwischen mobiler und stationärer Phase ist und ΔS0 die entsprechende Übergangsentropie sowie ß das Phasenverhältnis in der Trennsäule.

Gleichung 1
Gleichung 1 (Bild: Thermo Fisher Scientific)

Es ist leicht zu erkennen, dass die Auftragung von ln k gegen 1/T einen linearen Zusammenhang ergibt und sich somit die entsprechende Abhängigkeit eigentlich bereits mit zwei Messpunkten beschreiben lässt. Eine weiträumige Linearität besteht in der Praxis aber meist nur in guter Näherung, Abweichungen treten besonders in Fällen mit gemischten Retentionsmechanismen auf, wie sie in der HPLC jedoch sehr häufig vorkommen. Somit ist es zur etwas exakteren Bestimmung der entsprechenden Abhängigkeit ratsam, mindestens drei Messpunkte aufzunehmen. Weiterhin sollte auf Vorhersagen mittels Extrapolation auf Temperaturen außerhalb des gemessenen Bereichs verzichtet werden, weil dabei die Gefahr einen nichtlinearen Zusammenhang zu übersehen, entsprechend größer wird. Abbildung 1 zeigt ein van’t-Hoff-Diagramm für einen sehr interessanten Anwendungsfall. Es handelt sich um die Trennung der vier Konservierungsstoffe Dimethylphthalat, Methylbenzoat, Methylparaben und Ethylparaben an einer Umkehrphase mit eingebetteter polarer Gruppe, betrieben in einem Wasser-Methanol-Eluenten mit Phosphat auf pH 7 eingestellt. Die Messungen wurden in 5 °C-Schritten von 20 °C bis 75 °C aufgenommen und es zeigt sich über den gesamten Bereich eine gute Linearität, sodass auch mit deutlich weniger Messpunkten der Zusammenhang gut beschrieben werden könnte. Besonders auffällig sind die sehr unterschiedlichen Geradensteigungen, die letztlich auch zu Schnittpunkten der Geraden führen, also zu Elutionsumkehrungen im betrachteten Temperaturbereich. Dies hat für die Praxis ganz entscheidende Konsequenzen und es kann für den Erfolg der chromatographischen Trennung fatal sein, diese nicht entsprechend zu beachten.

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