GC/MS Aminosäuren voll automatisiert analysieren

Mitte des letzten Jahrhunderts kamen Experten auf die naheliegende Idee, durch Bestimmung der Aminosäurenkonzentration Stoffwechselerkrankungen zu diagnostizieren, da sie an vielen wichtigen Stoffwechselvorgängen beteiligt sind. Die Gaschromatographie verbunden mit der Massenspektrometrie (GC/MS) bietet ideale Voraussetzungen zur quantitativen Bestimmung von Aminosäuren in biologischen Matrices. Wie effizient die Analytik ist, hängt nicht zuletzt von ihrem Automatisierungsgrad ab.

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Aminosäuren sind für Mensch und Tier gleichermaßen wichtig, können jedoch nur in begrenztem Umfang vom Organismus produziert werden. Alle für Menschen essenziellen, das heißt lebensnotwendigen Aminosäuren müssen mit der Nahrung aufgenommen werden. Aminosäuren sind am Aufbau der Proteine beteiligt und erfüllen darüber hinaus eine Vielzahl weiterer Funktionen im Organismus. Die Aminosäure Tyrosin etwa wird zu Katecholamin umgewandelt, also in ein Hormon, das anregend und stabilisierend auf das Herz-Kreislaufsystem wirkt. Gluta-mat wiederum dient als Neurotransmitter zur Übertragung neuronaler Signale.

Aufgrund ihrer Einbindung in viele Stoffwechselvorgänge, lassen sich Aminosäuren als wichtige Marker u.a. für angeborene Stoffwechselerkrankungen verwenden. Zu den bekanntesten gehört die Phenylketonurie (PKU): Der Organismus ist nicht in der Lage, Phenylalanin abzubauen; die Aminosäure reichert sich im Körper an und beeinträchtigt die geistige Entwicklung des Menschen. Diagnostizieren lässt sich die PKU über die Bestimmung der deutlich erhöhten Phenylalanin-Konzentration. Aus praktischen Gesichtspunkten werden Aminosäuren in vitro insbesondere in Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma und Urin bestimmt.

Automatisierung bringt Zeitersparnis bei der Analyse

Zur Bestimmung von Aminosäuren in biologischen Proben kommen häufig kommerzielle Aminosäurenanalysatoren zum Einsatz. Ihr Funktionsprinzip basiert auf der Kationenaustausch-Chromatographie mit Nachsäulenderivatisierung und UV-Detektion. Nachteil dieser Methode ist ihr enorm hoher Zeitaufwand. Als attraktive weil effiziente Alternative empfiehlt sich die Gaschromatographie mit massenselektiver Detektion (GC/MS), wobei die Aminosäuren mittels Chlorameisensäurepropyl-ester in flüchtige und damit GC-gängige Derivate umgesetzt werden.

„Damit die Methode für einen hohen Probendurchsatz geeignet ist, haben wir die Probenvorbereitung vollständig automatisiert“, sagt Dr. Katja Dettmer, Projektleiterin Metabolomics am Institut für funktionelle Genomik von Prof. Dr. Peter Öfner an der Universität Regensburg. Alle relevanten Schritte, angefangen bei der Zugabe des internen Standards (IS) über die Derivatisierung bis zur Probenaufgabe in das GC/MS-System erfolgen mit der Dualrail-Variante des Multi-Purpose-Samplers (MPS-Prep-Station) von Gerstel. Dr. Dettmer: „Durch die Automatisierung konnten wir den manuellen Arbeitsaufwand minimieren und gleichzeitig die Reproduzierbarkeit verbessern.“

Die MPS-Prep-Station verfügt über zwei voneinander unabhängig arbeitende Roboterarme. Während einer im vorliegenden Fall für die Addition der Derivatisierungsreagenzien mit einer Flüssigspritze im mL-Maßstab ausgestattet ist, erfolgt die Zugabe des internen Standards (IS) sowie die Probenaufgabe der notwendig kleinen Probenmenge mit einer µL-Flüssigspritze. Neben diesem Hardware-spezifischen Aspekt bietet die Softwaresteuerung (Gerstel-Maes-tro) den Vorteil einer intuitiven Bedienoberfläche, bei der sich die erforderlichen Probenvorbereitungsschritte bequem aus einer Tabelle von Befehlen per Mausklick zusammenstellen und dank Prep-Ahead-Funktion mit der GC/MS-Analyse zeitlich verschachteln lassen.

Probenvorbereitung und GC/MS-Analyse

Und so gingen Dr. Dettmer und Kollegen bei der Aminosäurenbestimmung vor: Die biologische Probe, etwa Blut oder Urin, wurde in ein Glasrollrandfläschchen (Vial) dosiert und mit einem magnetischen Deckel luftdicht verschlossen. Die Vials wurden anschließend in den gekühlten Probenhalter der MPS-Prep-Station gestellt. Alle weiteren Schritte erfolgten automatisiert, dank magnetischer Verschlusskappen auch der Transport der Vials zum Schüttler, der die Probe auf Wunsch rührt und schüttelt sowie erwärmt und abkühlt. Zur Analyse wurden, je nach Probenmatrix, 20 bis 50 µL Probe eingesetzt. Folgende Schritte wurden von der MPS-Prep-Station vollautomatisiert durchgeführt:

• Zugabe des internen Standards (Mix von 20 uniform 13C- und 15N-markierten Aminosäuren und zwei deuterierte Verbindungen),
• der Verdünnungsschritt,
• Zugabe einer Natriumhydroxyd-Lösung, einer Picolin-Lösung, die als Katalysator fungiert, sowie des Derivatisierungsreagenz Chlorameisensäurepropylester,
• Mischen der Probe im Schüttler und
• Extraktion der gebildeten Derivate mit dem organischen Lösemittel Isooktan.

Isooktan bildet mit der wässrigen Probe im Zweiphasensystem die obere Phase. Mit einer 10 µL Spritze wurden daraus 2,5 µL entnommen und direkt in den Gaschromatographen injiziert. Die Trennung erfolgte auf einer ZB-AAA-Säule von Phenomenex. Verwendet wurde ein Agilent GC 6890, ausgestattet mit dem Gerstel-Kalt-Aufgabe-System (KAS) als PTV-Injektor. Zur Detektion wurde ein Agilent MSD 5975 parallel im Scan- und SIM-Modus betrieben, wobei für jede Aminosäure zwei charakteristische Massenfragmente aufgenommen wurden.

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