CHROMATOGRAPHIE Analytik von sprengstofftypischen Verbindungen

Durch sprengstofftypische Verbindungen verursachte Kontaminationen in der Umgebung ehemaliger Rüstungsstandorte sind von großer umweltrelevanter Bedeutung, da sie sich häufig in unmittelbarer Nähe zu Grund- und Trinkwasserreservoiren befinden und somit eine akute Belastung durch meist toxische und karzinogene Sprengstoffmetabolite darstellen.

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Durch sprengstofftypische Verbindungen verursachte Kontaminationen in der Umgebung ehemaliger Rüstungsstandorte sind von großer umweltrelevanter Bedeutung, da sie sich häufig in unmittelbarer Nähe zu Grund- und Trinkwasserreservoiren befinden und somit eine akute Belastung durch meist toxische und karzinogene Sprengstoffmetabolite darstellen. Zur Einschätzung des Gefährdungspotenzials für die Umwelt bedarf es daher einer umfassenden qualitativen und quantitativen Bestimmung der durch unterschiedliche chemische Eigenschaften charakterisierten sprengstofftypischen Verbindungen (STV).

Obwohl sich die Anzahl der im Zweiten Weltkrieg produzierten Sprengstoffe auf wenige Verbindungen beschränkt, ist das tatsächlich zu erwartende Schadstoffspektrum einer Rüstungsaltlast wesentlich größer, da zusätzlich mit Nebenprodukten der Sprengstoffherstellung sowie mit Abbau- und Umwandlungsprodukten zu rechnen ist.

Dabei handelt es sich um ein sehr umfangreiches Substanzspektrum mit einem weiten Bereich der für eine Analytik relevanten Eigenschaften wie Acidität, Polarität, Wasserlöslichkeit, thermische Stabilität sowie mit einem weiten Konzentrationsbereich (0,1 - 200 µg/l): Nitrotoluole (NT), Aminonitrotoluole (ANT), Nitramine, Nitrobenzole (NB), Nitrophenole (NP), Nitroamonophenole (NAP), Nitrobenzoesäuren (NBS), Nitroaminobenzoesäuren (NABS), Nitrotoluolsulfonsäuren (NTSS) u.a. Polare Sprengstoffmetabolite besitzen wegen einer höheren Wasserlöslichkeit eine größere Mobilität im Wasser-Boden-System und weisen damit ein größeres Gefährdungspotenzial auf.

Zudem sind die aus der Reduktion der Nitrogruppen resultierenden aminoaromatischen Verbindungen meist toxischer als ihre Ausgangsverbindungen.

Analytische Verfahren

Als Standardmethode für die Analytik sprengstoffrelevanter Verbindungen in Wasserproben hat sich die HPLC-UV mit Lösungsmittelextraktion oder Festphasenextraktion als Anreicherungsschritt zur Entfernung von Matrixbestandteilen und zur Steigerung der Nachweisempfindlichkeit etabliert. Allerdings reicht das Trennvermögen der üblichen HPLC-Säulen nicht aus, um Interferenzen durch koeluierende Komponenten, die mit UV-Detektion nicht auflösbar sind, zu vermeiden. Zur Trennung von polaren nitroaromatischen Verbindungen an RP-Säulen wählt man möglichst niedrige pH-Werte, um die Ionisierung zu unterdrücken. In jüngster Zeit wurden jedoch zahlreiche stark saure sprengstofftypische Verbindungen gefunden. Die Stabilität der RP-Säulen ist bei stark sauren Bedingungen (pH < 2), die für eine Trennung dieser sauren STV in ihrer Neutralform günstig wären, nicht mehr gewährleistet.

Bestimmung mittels HPLC-UV

Zur analytischen Begleitung einer Reinigungsanlage für kontaminiertes Wasser einer Rüstungsaltlast (Elsnig bei Torgau, Sachsen) wurden 15 STV mit unterschiedlicher Polarität und Acidität ausgewählt (Abb. 1a), die in einem chromatographischen Lauf zu erfassen waren. Neben dem weiten Polaritäts- und Konzentrationsbereich wurde die Etablierung eines routinetauglichen Bestimmungsverfahrens durch Retentionszeitschwankungen für einige Peaks im vorderen Bereich, Koelutionen mit nicht identifizierten Substanzen sowie durch die begrenzte Stabilität der verwendeten Trennsäulen erschwert.

Für die Extraktion und Anreicherung der Analyten wurde eine Festphasenextraktion (SPE) an einem Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer (LiChrolut EN, Merck) durchgeführt. Um dabei ein breites Substanzspektrum bezüglich der pKS-Werte zu erfassen, wurde unter drei verschiedenen pH-Bedingungen extrahiert (pH 1, 9 und 12).

Die nachfolgende Trennung der sprengstofftypischen Verbindungen wurde mittels HPLC-UV an einer RP-18 Phase mit einem Wasser-Acetonitril-Gradienten und konstantem Pufferzusatz (10% 0,04 M Ammoniumacetat-Essigsäure-Puffer, pH 4,0) erreicht. Die Detektion erfolgte simultan bei drei verschiedenen Wellenlängen.

Ein HPLC-UV-Chromatogramm (254 nm) einer Elsniger Wasserprobe wird in Abb. 1b gezeigt. Neben den kalibrierten Verbindungen erscheinen besonders in der Region mit kürzerer Retention, wo polarere Komponenten erwartet werden, viele zusätzliche unbekannte Peaks. Auf der Suche nach solchen unbekannten polaren hydrophilen Verbindungen sowie zur Erkennung möglicher Koelutionen wurde die Kopplung der Flüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie gewählt. Dabei wurde als Interface eine Elektrospray-Ionenquelle eingesetzt, die insbesondere für die Ionisierung polarer und stark polarer Verbindungen wie Benzoesäuren, Sulfonsäuren und Phenolen geeignet ist.

LC-ESI-MS/MS Methode

Zur Kopplung wurde ein Tripel-Quadrupol-Massenspektrometer (API 2000, Applied Biosystems) benutzt; die für die HPLC-UV genutzten chromatographischen Bedingungen mussten entsprechend verändert werden. Ein wichtiges Kriterium dabei bestand in der Verwendung eines flüchtigen Puffers und in der Senkung der Pufferkonzentration. Der Einsatz eines Puffers ermöglicht und verbessert zum einen die HPLC-Trennung und unterstützt zum anderen die Ionenbildung in der Elektrosprayquelle.

Nachteilig sind die Bildung intensiver Untergrundionen, die die Analytionisierung unterdrücken, sowie eine Adduktionenbildung mit den Analyten. Für die Unterstützung der Dissoziation und damit der Ionisierung saurer Komponenten wäre ein Puffermilieu oberhalb ihrer pKS-Werte vorteilhaft, was aber aufgrund der starken Erniedrigung der Retention saurer Analyten auf RP-Phasen die chromatographische Trennung erschwert. Als Kompromiss wurde ein pH-Wert von vier gewählt.

Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Ein weiterer Faktor war die Verringerung der LC-Flussrate durch eine Trennsäule mit geringerem Innendurchmesser (2,1 x 50 mm x 3,5 µm). Es wurde ein Wasser-Acetonitril-Gradient mit einem konstanten Pufferanteil von 10 Prozent (10 mM CH3COONH4/ CH3COOH, pH 4,0) und einer Flussrate von 100 µl/min gewählt; das Injektionsvolumen betrug 10 µl.

Von den verschiedenen MS/MS-Techniken wurde das Multiple Reaction Monitoring (MRM), der selektivste und sensitivste Messmodus eines Tripel-Quadrupol-Massenspektrometers, angewandt. Da dieser MRM-Modus eine target-Analyse darstellt, können die Messparameter für die interessierenden Analyten optimal eingestellt werden. Weiterhin eignet er sich zu Quantifizierungszwecken.

Der Nachteil besteht zum einen in der Beschränkung auf zuvor ausgewählte Verbindungen und zum anderen darin, dass die Methodik auf verfügbare Standards angewiesen ist. Eine Analyse unbekannter Substanzen ist mit MRM nicht möglich (s. Abb. 3). Bei der Suche nach geeigneten MRM-Übergängen zeigten sich große Unterschiede in der Ionisierungsausbeute unter den Bedingungen der Atmosphärendruckionisation. Interessanterweise konnte z.B. von der sehr gut ionisierbaren 2,4-Dinitrobenzoesäure kein Massensignal erhalten werden, weil offensichtlich in der heißen Sprühkapillare (450 °C) eine Decarboxylierung erfolgt.

Bei Anwendung der LC-MS/MS-Methode auf Wasserproben der Rüstungsaltlast Elsnig bei Torgau (Sachsen) konnten unter anderem relativ große Mengen zweier Dinitrotoluolsulfonsäure-Isomere bestätigt werden. Nitrotoluolsulfonsäuren fallen als Nebenprodukte der TNT-Herstellung an und sind wegen ihres hohen toxikologischen Potenzials von besonderer Relevanz. Weiterhin wurden andere stark polare Sprengstoffmetabolite wie 2,4,6-Trinitrobenzoesäure und 3,5-Dinitrobenzoesäure detektiert.

Koelutionen in der HPLC-UV

Mit Hilfe der neu erstellten LC-MS/MS-Methode konnten in Elsniger Wasserproben eine Reihe weiterer polarer sprengstoffrelevanter Verbindungen identifiziert werden, die mittels HPLC-UV bisher nicht zugeordnet werden konnten. Um diese in den HPLC-UV-Chromatogrammen zu lokalisieren sowie vermutete Koelutionen zu erkennen, wurde das Retentionsverhalten dieser Komponenten in der etablierten HPLC-Trennung mit UV-Detektion untersucht. Alle betrachteten Verbindungen (3,5-DNBS, 4-ABS, 2-A-4-NBS, 2-M-3-NP, 4-NBS, 3,5-DNA, 2,4,6-TNBS, 2-A-4,6-DNBS, 2,4-DNTSS-5, 2,4-DNTSS-3, Pikrinsäure) eluieren innerhalb des für andere sprengstofftypische Verbindungen (Abb. 1a) erarbeiteten Gradientenprogrammes als weitgehend symmetrische Einzelpeaks mit reproduzierbarer Retentionszeit. Dabei eluieren alle acht Benzoe- und Benzolsulfonsäuren erwartungsgemäß im vorderen Bereich der Chromatogramme (1 bis 10 Minuten). In den Chromatogrammen realer Wasserproben tritt gerade in diesem Bereich eine Vielzahl unbekannter Peaks auf. Dagegen eluieren die drei restlichen Verbindungen 2-M-3-NP, 3,5-DNA und 2,4,6-TNP zwischen 15 und 17 Minuten.

Es zeigt sich, dass besonders im Falle polarer STV eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Peaküberlagerung besteht. So kann 2,4-DNBS von 2-A-4,6-DNBS und 4-NBS überlagert werden (s. Abb. 2). In direkter Nähe zu 2,4-DNP eluieren 2,4-DNTSS-3, 2-A-4-NBS und 3,5-DNBS, während der Peak von 3,5-DNA an 3,5-DNP angrenzt. Insbesondere die beiden Sulfonsäuren kommen in den Elsniger Rohwasserproben in relativ hohen Anteilen vor.

Diese Koelutionen sind offensichtlich die Ursache für schwankende Retentionszeiten sowie für Probleme bei der Identifizierung und Quantifizierung insbesondere von 2,4-DNBS, 2,4-DNP und 3,5-DNP im Zuge der prozessbegleitenden Routineanalysen. Selbst bei der Methode der Standardaddition bleibt in einigen Fällen eine Zuordnung anhand der UV-Detektion mit Unsicherheiten behaftet, da aufgrund der geringen Konzentrationen mancher Verbindungen ein Vergleich der UV-Spektren der unbekannten Peaks mit entsprechenden Substanzspektren nicht sehr aussagekräftig ist. Weiterhin stimmen sehr viele kleine Peaks mit keiner der addierten Substanzen überein, so dass in den Elsniger Wässern noch mit weiteren sprengstoffrelevanten Verbindungen gerechnet werden muss.

Es ist auch anzunehmen, dass die stark polaren bzw. sauren Verbindungen (Nitrobenzoesäuren, Nitrotoluolsulfonsäuren, Nitrophenole) für den schnellen Verschleiß der chromatographischen Trennsäulen während der Messserien stark belasteter Realproben verantwortlich sind.

Zusammenfassung und Ausblick

Umweltproben von ehemaligen Rüstungsstandorten sind mit zahlreichen unterschiedlichen Abbau- und Umwandlungsprodukten der ursprünglich produzierten Sprengstoffe sowie deren technischen Nebenprodukten kontaminiert. Eine zuverlässige simultane Erfassung möglichst aller dieser sprengstofftypischen Verbindungen stellt immer noch eine große Herausforderung an die zu entwickelnden Analysenverfahren dar

Probleme mit Peaküberlappungen in komplexen Chromatogrammen erschweren die Auswertungen von HPLC-Trennungen mit UV-Detektion. Der Einsatz eines hochspezifischen massenselektiven Detektors kann durch Identifizierung stark polarer Sprengstoffmetabolite zur Aufklärung von Koelutionen beitragen. In von Rüstungsaltlasten stammenden Wasser- und Bodenproben wurden bisher etwa 50 STV gefunden.

Es kann noch mit weiteren sprengstoffrelevanten Verbindungen, zum großen Teil vermutlich Isomere bereits identifizierter Bestandteile, gerechnet werden, für deren Identifizierung und Quantifizierung eine Kopplung der HPLC mit MS und NMR prädestiniert sind.

Die Autoren danken Herrn Dr. Klaus Steinbach,Leiter MS-Labor Universität Marburg, für die zur Verfügung gestellten Substanzen und Frau Anke Weiske für die experimentelle Unterstützung.

DIE AUTORENProf. Dr. Werner Engewald: Chemiestudium Universität Leipzig; 1968 Promotion; 1978 Habilitation; seit 1985 Professor für Analytische Chemie an der Leipziger Universität; seit Okt. 2002 im Ruhestand; Vorstandsmitglied der GDCh Fachgruppe Analytische ChemieDr. Anne-Christine Schmidt: Studium Biologie und Physikalische Chemie an der Universität Leipzig, Postgradualstudium Analytik und Spektroskopie an der Universität Leipzig; 2003 Promotion Umweltforschungszentrum Leipzig, 2003–2005 Postdoc im Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie Halle/ Saale und an der Universität Leipzig, Institut für Analytische Chemie; seit 2005 wiss. Mitarbeiter an der TU Bergakademie Freiberg, Institut für Analytische Chemie Brigitte Niehus: 1969– 1973 Chemie- Studium an der Karl-Marx-Universität Leipzig; 1983–1985 Postgradualstudium „Analytik und Spektroskopie“; 1992–1994 Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbH; 2000–2004 Fachhochschule Halle-Merseburg; 07–12/2004 Universität Leipzig Priv.-Doz. Dr. F.-M. Matysik : 1994 Chemiestudium und Promotion Universität Leipzig; 2001 Habilitation im Fach Analytische Chemie; seit 2002 Privatdozent am Institut für Analytische Chemie der Universität Leipzig

* Technische Universität Bergakademie Freiberg, Fakultät für Chemie und Physik, Institut für Analytische Chemie** Universität Leipzig, Fakultät für Chemie und Mineralogie, Institut für Analytische Chemie

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