Flüssigchromatographie Authentizität von Kaffee mit der HPLC bestimmen

Ob es sich bei einem Kaffeepulver um hochwertigen Arabica- oder um billigeren Robusta-Kaffee handelt, lässt sich allein aufgrund des Aussehens nicht entscheiden. Eine Möglichkeit zur analytischen Differenzierung bietet die Markersubstanz 16-O-Methylcafestol. Mit ihrer Hilfe lässt sich über eine HPLC-Methode noch geringste Mengen Robusta nachgewiesen werden.

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Coffea L. ist eine Gattung aus der Familie der Rubiaceae (Rötegewächse). Von den ungefähr 70 bekannten Coffea-Arten besitzen nur zwei eine herausragende wirtschaftliche Bedeutung: Der auch als Hochlandkaffee bezeichnete Coffea arabica (Arabica), der in einer Höhe zwischen 900 und 2000 Metern angebaut wird und der wesentlich weniger anspruchsvolle Coffea canephora var robusta (Robusta), der mehr Feuchtigkeit und Hitze toleriert und zwischen Meereshöhe und 800 Meter über dem Meeresspiegel wächst.

Kaffee ist nach Erdöl das zweitwichtigste Handelsgut der Welt. Der Hauptproduzent ist Brasilien mit über zwei Millionen Tonnen pro Jahr. Vietnam belegt mit ca. einer Million Tonne jährlich den zweiten Platz. 2006 wurden in Deutschland ca. 510 000 Tonnen Rohkaffee zu etwa 390 000 Tonnen Röstkaffee und 17 000 Tonnen löslichem Kaffee verarbeitet. Die deutsche Kaffeewirtschaft erzielte einen Umsatz von ca. 4,25 Milliarden Euro [1,2].

Kaffee im Vergleich

Im Vergleich zum Arabica gilt Robusta-Kaffee als die qualitativ minderwertigere Sorte. Dies spiegelt sich auch im Preis wieder. Während aktuell für Arabica Preise von ca. 140 US-Cent pro Pfund erzielt werden, liegt der Erlös für Robusta bei ca. 100 US-Cent. Robusta ist vor allem ein wichtiger Bestandteil von Kaffeemischungen, um den Geschmack abzurunden, den Koffeingehalt zu steigern, aber auch um das Preisniveau zu senken. Arabica hingegen wird häufig sortenrein angeboten und entsprechend angepriesen.

Im ungemahlenen Zustand sind Arabica- und Robusta-Bohnen sehr leicht zu unterscheiden. Robustas sind klein und rundlich, Arabica-Bohnen größer und länglich. Für die Käufer gemahlener Röstkaffees entfällt dieses Unterscheidungskriterium jedoch. Es verbleibt nur die Möglichkeit der sensorischen Prüfung. Selbst ein geübter Kaffeetester ist kaum in der Lage einen Robusta-Anteil von unter 20 Prozent in Kaffeemischungen zu erschmecken. Objektive Aussagen sind auf diese Weise ohnehin nicht möglich. Für eine quantitative Analyse des Robusta-Anteils in Kaffeemischungen und lebensmittelrechtliche Überprüfung von Werbeaussagen bezüglich des Arabica-Anteils muss eine Untersuchung anhand der chemischen Inhaltsstoffe erfolgen. Hierzu wurden in der Vergangenheit verschiedene Methoden entwickelt. Unter anderem analysierte man in grünen Kaffees die Gehalte verschiedener Metalle, in Roh- und Röstkaffees die Enantiomerenverhältnisse der Aminosäuren und die Gehalte freier sowie konjugierter biogener Amine. In Röstkaffees wurden die Konzentrationen von Trigonellin, Nicotinsäure und Koffein oder die Gehalte bestimmter Sterole ermittelt. Eine sichere Aussage über den Robusta-Anteil in einer Kaffeemischung ist mit diesen Methoden nur bei sehr hohen Robusta-Gehalten möglich. Der Nachweis eines Robusta/Arabica-Verschnitts im unteren Prozentbereich ist anhand dieser Parameter nicht realisierbar [2].

Differenzierung über Lipide

Die Untersuchung der Kaffeelipide erbrachte schließlich ein Unterscheidungskriterium. Der Gesamtlipidgehalt bei Robusta liegt im Mittel bei ca. 10, bei Arabica bei ca. 15 Prozent. Der überwiegende Teil dieser Lipide ist als Kaffeeöl im Endosperm der Kaffeebohne verteilt, nur ca. ein bis zwei Prozent umgeben die Bohne als Kaffeewachs. Etwa 75 Prozent der Gesamtlipide sind Triglyceride, deren Zusammensetzung bei beiden Kaffeesorten identisch ist. Die vorherrschenden Fettsäuren sind Linol- und Palmitinsäure. Neben den Triglyceriden enthält das Kaffeeöl ca. 19 Prozent Diterpene und fünf Prozent Sterole. Als Minorkomponenten sind außerdem Phosphatide, Tocopherole und die antioxidativ wirksamen Carbonsäure-5-hydroxtryptamide enthalten. Außergewöhnlich hoch ist somit der Anteil der unverseifbaren Komponenten im Kaffeeöl, bei denen es sich vor allem um pentazyklische Diterpenalkohole vom Kauran-Typ handelt. Sie finden sich im Kaffeeöl nahezu ausschließlich als Ester der Palmitin- und Linolsäure. Nur ein sehr geringer Anteil von ca. 0,4 Prozent liegt in freier Form vor [3].

Die Hauptditerpene aus Arabica wurden bereits in den 30er Jahren des letzten Jahrhunderts identifiziert und als Cafestol und Kahweol bezeichnet [4, 5]. Kahweol wurde lange als Marker für Arabica angesehen, da es mit den zum damaligen Zeitpunkt eingesetzten analytischen Methoden in Robusta nicht nachweisbar war. Erst später konnte es mithilfe empfindlicherer Methoden dort detektiert werden, allerdings in deutlich geringeren Konzentrationen. Erst in den achtziger Jahren wurde im Rahmen einer Forschungsarbeit zur Identität der Kaffee-Diterpenester ein weiterer Diterpenalkohol detektiert und als 16-O-Methylcafestol (16-OMC) identifiziert (Abbildung 2) [6, 7]. Bis heute wurde das 16-OMC ausschließlich in Robustas nachgewiesen. Die Diterpengehalte bezogen auf die Trockenmasse des Rohkaffees sind in Tabelle 1 dargestellt. Mit dem 16-O-Methylcafestol steht nun ein exklusiv in Robustas vorkommender Marker zur Verfügung, mit dem selektiv ein Zusatz von Robusta zu Kaffeemischungen nachweisbar ist. Da das 16-OMC im Gegensatz zum Cafestol und Kahweol auch während der drastischen Temperaturbedingungen der Kaffeeröstung weitgehend stabil bleibt, kann es als Marker sowohl für Roh- und Röstkaffees, als auch für Kaffeeprodukte eingesetzt werden.

HPLC-Nachweis

Die Analytik des 16-OMC ist sowohl gaschromatographisch nach Silylierung oder mittels HPLC ohne Derivatisierung möglich. In Deutschland ist das HPLC-Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes an 16-O-Methylcafestol in Röstkaffee vom Deutschen Institut für Normung in der DIN 10779, 1999 veröffentlicht und 2004 bestätigt worden [9]. Diese Methode findet als amtliche Methode nach § 64 LFGB in der Lebensmittelüberwachung Anwendung. Für eine Gehaltsbestimmung werden zunächst die Kaffeelipide isoliert. Im Anschluss erfolgen die Verseifung der Lipide, darunter die Diterpenalkoholester, und die Extraktion des unverseifbaren Anteils, darunter die Diterpenalkohole Kahweol, Cafestol und 16-OMC, sowie einige bei der Röstung entstehende Abbauprodukte. Schließlich erfolgt die Trennung auf RP18-Material und die Quantifizierung nach dem Verfahren des externen Standards gegen eine kommerziell erhältliche 16-O-Methylcafestol-Referenzsubstanz.

Die Röstkaffeebohnen werden hierzu gemahlen und durch Aussieben eine definierte Korngrößenfraktion für die Analytik selektiert. Auch handelsüblicher bereits gemahlener Röstkaffee, der diesen Korngrößenanforderungen nicht entspricht, muss nachgemahlen werden. Das Kaffeemehl wird mit Natriumsulfat verrieben und einer mehrstündigen Soxhlet-Extraktion mit tertiärem Butylmethylether unterzogen. Ein Aliquot dieser Lösung wird nach Zugabe von ethanolischer Kaliumhydroxidlösung über einen Zeitraum von zwei Stunden unter Rückfluss verseift. Der Rückstand wird mit warmem Wasser und unter Nachspülen mit Methanol in einen Scheidetrichter überführt. Anschließend wird mehrfach mit tertiärem Butylmethylether ausgeschüttelt. Die durch die alkalische Hydrolyse abgespaltenen Fettsäuren verbleiben dabei in der wässrigen Phase, während die freigesetzten Diterpenalkohole in die organische Phase übergehen. Die vereinigten Etherphasen werden mit Natriumchloridlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer vollständig zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Dichlormethan aufgenommen und auf ein definiertes Volumen aufgefüllt. Ein Aliquot dieser Lösung wird im Stickstoffstrom zur Trockne eingeengt und im später eingesetzten HPLC-Fließmittel oder direkt in reinem Acetonitril gelöst. Gegebenenfalls erfolgt bei trüben Lösungen noch eine Membranfiltration, bevor die isokratische HPLC-Trennung auf einer analytischen RP18-Phase erfolgt [9]. Beispielhafte Chromatogramme des unverseifbaren Anteils eines Arabica- und Robusta-Röstkaffees sind in Abbildung 3 dargestellt.

Die Chromatogramme zeigen deutlich die Trennung der Diterpenalkohole Kahweol, Cafestol und 16-O-Methylcafestol. Robusta weist wesentlich geringere Gehalte an Kahweol auf, enthält dafür aber exklusiv das 16-O-Methylcafestol, welches in Arabica völlig fehlt. Schon die Detektion geringster Spuren an 16-OMC in der untersuchten Probe ist daher ein eindeutiger Indikator für das Vorhandensein von Robusta. Basierend auf den publizierten Gehalten von 0,6 bis 1,2 g/kg 16-OMC in Robustas (s. Tab. 1) erlaubt die beschriebene Methode den Nachweis von unter zwei Prozent Robusta in der Kaffeeprobe. Eine genaue quantitative Aussage ist nur möglich, wenn der entsprechende für die Mischung eingesetzte Robusta als Vergleichsmuster vorliegt, ansonsten ist nur eine Schätzung unter Berücksichtigung der genannten Gehalte möglich. Wie bei allen analytischen Verfahren sollte großer Wert auf die Qualität der eingesetzten Referenzsubstanz gelegt werden. Ein Ergebnis kann nur so genau wie die zugrunde liegende Vergleichssubstanz sein, die daher nicht nur bezüglich Ihrer Identität, sondern auch bezüglich Ihres Absolutgehalts unter Berücksichtigung der chromatographischen Reinheit sowie des Restwasser- und Restlösungsmittelgehalts umfassend charakterisiert sein sollte. Derartige quantitativ zertifizierte Referenzsubstanzen sind bei spezialisierten Herstellern für zahlreiche Applikationen kommerziell verfügbar.

MS-Identifizierung

Aufgrund des unspezifischen UV-Spektrums des 16-O-Methylcafestols können Peaküberlagerungen, beispielsweise als Resultat einer unvollständigen Hydrolyse der Kaffeelipide, mittels einfacher UV- oder Diodenarray-Detektion nicht völlig ausgeschlossen werden. Die Folge wären falsch-positive Robusta-Nachweise oder überhöhte Angaben zum Gehalt des 16-OMC in der analysierten Probe. Mehr Sicherheit bei der Peakzuordnung bieten die heute in analytischen Laboratorien weit verbreiteten HPLC-MS(/MS)-Systeme, mit denen eine selektive Detektion und sichere Identifizierung aufgrund des Molekulargewichts und spezifischer Fragmentierungsmuster möglich ist. Ein im positiven Modus aufgenommenes Elektrospray-Massenspektrum von 16-OMC zeigt Abbildung 4. Das Molekulargewicht des 16-OMC beträgt 330,47 g/mol (Summenformel: C21H30O3). Im positiven Massenspektrum des 16-OMC ist das Molekülion bei m/z 331 erkennbar, es stellt jedoch nicht das Hauptsignal dar. Detektiert wird vor allem das Natriumaddukt bei m/z 353 sowie das bereits durch Abspaltung der Methoxygruppe entstandene stabile Fragment bei m/z 299, welches zur Identifizierung herangezogen werden kann. In MSn-Experimenten bildet sich aus diesem Fragment im ersten Schritt durch Wasserabspaltung ein Fragment mit m/z 281, das weitere Fragmentierungsmuster beruht auf dem Zerfall des Diterpen-Grundgerüsts.

Neben dem Vorteil der selektiven Detektion kann durch den Einsatz der Massenspektrometrie eine wesentlich niedrigere Bestimmungsgrenze erreicht werden. Abbildung 5 zeigt einen Vergleich der mittels UV- und MS-Detektion erhaltenen HPLC-Chromatogramme einer Kaffeeprobe. Während das Signal des 16-O-Methylcafestols bei UV-Detektion für diese Probe nahe der Nachweisgrenze ist, wird mittels massenspektrometrischer Detektion noch ein klares Signal erhalten. Die Bestimmungsgrenze kann durch den Einsatz der HPLC-MS/MS-Technik auf ca. 0,2 Prozent Robusta verringert werden [10].

Dem Konsumenten und Kaffeeliebhaber kann durch diese auch in der amtlichen Lebensmittelüberwachung etablierten Verfahren die Sicherheit gegeben werden, dass in „100 Prozent Arabica“ kein Robusta steckt. Die kaffeeverarbeitende Industrie kann bereits bei der Wareneingangskontrolle der Rohkaffees garantieren, dass kein ungewollter Verschnitt in die Produktion gelangt. Die Lieferanten wiederum sind angehalten, durch ein optimales Rohwarenhandling eine ungewollte Sortenmischung zu vermeiden. Einem ungestörten Kaffeegenuss steht somit nichts mehr im Wege.

Literatur

[1] Deutscher Kaffeeverband; http://www.kaffeeverband.de.

[2] Scharnhop, H. Anwendung der High-Speed Countercurrent Chromatography zur Fraktionierung und Isolierung von Kaffeeinhaltsstoffen, Dissertation, Technische Universität Braunschweig, 2007; Cuvillier Verlag, Göttingen, 2007.

[3] Maier, H. G.; Kaffee, Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, 1981.

[4] Bengis, R. O., Anderson, R. J.; The chemistry of the coffee-bean I. Concerning theunsaponifiable matter of the coffee-bean oil. Preparation and properties for kahweol, J. Biol. Chem., 1932, 97, 99-113.

[5] Slotta, K. H., Neisser, K.; Zur Chemie des Kaffees, III. Mitteil.: Die Gewinnung von Cafesterol und anderen Verbindungen aus dem Unverseifbaren des Kaffee-Öls, Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1938, 71B, 1991-1994.

[6] Pettitt, B. C.; Identification of the diterpene esters in arabica and canephora coffees, J. Agric. Food Chem., 1987, 35, 549-551.

[7] Speer, K., Mischnick, P.; 16-O-Methylcafestol: ein neues Diterpen im Kaffee; Entdeckung und Identifizierung, ZLUF, 1989, 189, 219-222.

[8] Speer, K., Montag, A.; 16-O-Methylcafestol: ein neues Diterpen im Kaffee; Erste Ergebnisse: Gehalte in Roh- und Röstkaffees, Deutsche Lebensmittel-Rundschau, 1989, 85, 381-384.

[9] Deutsches Institut für Normung e.V.; DIN 10779, Bestimmung des Gehaltes an 16-O-Methylcafestol in Röstkaffee - HPLC-Verfahren, 1999.

[10] Bonnländer, B., Wünnecke, H., Winterhalter, P.; Rapid and sensitive detection of Robusta traces in coffee blends, Poster, Deutscher Lebensmittelchemiker Tag 2006, Dresden.

* Dr. M. Schwarz, Phytolab GmbH & Co. KG, 91487 Vestenbergsgreuth

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