SPECIAL PROBENVORBEREITUNG Automatisierte Gesamt RNA-Isolierung

Genexpressionsstudien werden immer häufiger in der akademischen und industriellen Forschung eingesetzt. Am Beispiel der vollautomatisierten Gesamt RNA-Isolation aus Säugetiergewebe soll eine Automationslösung zur schnellen und zuverlässigen Gewinnung hochreiner Gesamt-RNA für Hochdurchsatz Genexpressionsexperimente aufgezeigt werden.

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Genexpressionsstudien werden immer häufiger in der akademischen und industriellen Forschung eingesetzt. Am Beispiel der vollautomatisierten Gesamt RNA-Isolation aus Säugetiergewebe soll eine Automationslösung zur schnellen und zuverlässigen Gewinnung hochreiner Gesamt-RNA für Hochdurchsatz Genexpressionsexperimente aufgezeigt werden.

Bei Genexpressionsstudien treten besonders bei höherem Micorarray-Durchsatz oft Engpässe bei der Isolierung von Gesamt-RNA aus menschlichen oder tierischen Zellen oder Gewebe auf. Die händische Isolierung ist aufwändig und anfällig für Fehler - und die Ergebnisse sind nur so genau und reproduzierbar wie die angewendeten Probenvorbereitungs- und Reaktionsansatzmethoden.

Das folgende Beispiel der Gesamt RNA-Isolation aus Säugetiergewebe auf Theonyx (Abb. 1) mit dem NucleoSpin 96 RNA Kit von Macherey-Nagel zeigt eine Automationslösung zur Gewinnung hochreiner Gesamt-RNA für Hochdurchsatz-Genexpressionsexperimente.

RNA-Isolationsprinzip

Die Methode basiert auf der reversiblen Adsorption der RNA auf einer Silika-Oberfläche. Das Gewebe wird zunächst in einem Lyse-Puffer mit einer hohen Konzentration chaotrophischer Salze homogenisiert. Der Lyse-Puffer inaktiviert die RNAse und schafft die Bedingungen für die Bindung der RNA an die Silika-Membran (Abb. 2). Kontaminierende DNA wird im Aufreinigungsprozess durch DNAse I-Verdau direkt auf der Silika-Membran entfernt. Nach einer Reihe von Waschschritten wird die aufgereinigte RNA schließlich unter schwach ionischen Bedingungen mit RNAse-freiem Wasser eluiert.

Smart Logic - Bewegung der Spitzen

Auf Theonyx kommt „Smart Logic“, die gegenwärtig flexibelste automatisierte Spitzensteuerungs-Logik zum Einsatz. Je nach Bedarf kann das System mit Einmalspitzen zwischen 10 µl und 1 ml mit oder ohne Filterbarrieren ausgestattet werden. Dies ist ein entscheidender Vorteil, wenn sehr unterschiedliche Flüssigkeitsvolumina in ein und dem selben Applikations-skript pipettiert werden müssen, wie dies z.B. erforderlich ist, wenn man zuerst eine Gesamt-RNA Isolierung durchführen möchte (mittlere bis große Volumina) und im Anschluss daran einen Real Time-PCR Ansatz (geringe bis mittlere Volumina).

Bei der Erstellung eines Skriptes mit der RoboManager Software für Theonyx kann der Anwender somit je nach Bedarf für jeden Pipettierschritt eine andere Spitze auswählen. Die Software verwaltet dabei eigenständig die Entnahme der Spitzen aus den jeweiligen Hotels und wählt automatisch die nächste verfügbare Spitze. Durch die Stapelbarkeit der Hotels verfügt die Plattform über ein großes Reservoir an Einwegspitzen. Die leeren Hotels transportiert der Greifer auf freie von der RoboManager Software automatisch definierte Positionen.

Proben-Homogenisierung

Im nächsten Schritt werden Kundenproben (Hirn- & Lebergewebe von Mäusen, Lundbeck A/S, Kopenhagen) zur Homogenisierung in Tubes übertragen und gewogen. Der Probe werden Lyse-Puffer und Homogenisierungs-Kugeln zugefügt, danach werden die Tubes 20 s im Gewebe-Homogenisierer (FastPrep 120A, Q.biogene Inc.) prozessiert. Nach der Homogenisierung werden die Proben fünf min auf Eis inkubiert und dann fünf min mit 14000 U/min zentrifugiert. Die Überstände werde in frische 1,5 ml Eppendorff Tubes übertragen, danach zentrifugiert man die Proben weitere fünf min. Die so erhaltenen Überstände (130 µl) werden wiederum in frische Tubes übertragen und sofort auf Eis gelagert oder bei -80 °C eingefroren. Die Proben werden erst unmittelbar vor der Weiterverarbeitung auf dem Roboter in Mikrotiterplatten pipettiert.

Methode

Die Arbeitsfläche und die probenverarbeitenden Teile des Roboters werden zunächst gründlich mit RNAse Zap (Ambion Inc.) gereinigt. Die gereinigten Homogenate in der Mikrotiterplatte werden gemeinsam mit allen nötigen Zusatzkomponenten einschließlich Einmalspitzen mit Filter (in diesem Fall sowohl 175 µl als auch 1000 µl Einmalspitzen), einer Macherey-Nagel NucleoSpin 96 RNA Filterplatte, Elutionsplatte und Puffer auf den Roboter gebracht. Der anschließende Aufreinigungsprozess läuft vollautomatisch ohne jeglichen weiteren Benutzereingriff ab:

- 130 µl Binde- und Waschpuffer RA4 wird jeder Probe zugefügt und gemischt- 265 µl von jeder Probe werden aus dem jeweiligen Probenbehälter in der Mikrotiterplatte in den entsprechenden Behälter der Filterplatte auf der Vakuumkammer transferiert- Die RoboManager Software baut vollautomatisch 60 s lang einen Unterdruck von 300 mbar auf- Aus dem Reagenzspeicher werden in jeden Behälter der Filterplatte 500 µl Entsalzungspuffer RA3 gegeben- Ein Unterdruck von 300 mbar wird über 180 s angelegt- Aus dem Reagenzspeicher werden in jeden Behälter der Filterplatte 60 µl DNAse-Lösung gegeben- Nacheinander werden die Proben mit 500 µl RA2, 800 µl RA3 und 500 µl RA4 Puffern gewaschen. Nach der Zugabe jedes Waschpuffers wird jeweils 60 s lang ein Unterdruck von 400 mbar aufgebaut- Der Plattengreifer transportiert die Filterplatte auf eine sogenannte „Kontaktposition“. Das absorbierende Material auf der Kontaktposition entfernt alle verbliebenen Tröpfchen von den Filtersäulenspitzen (Abb.3)- Die Platte wird in die Vakuumkammer zurück transportiert und die Filtermembran 20 min lang bei einem Unterdruck von 500 mbar vollständig getrocknet- Im Anschluss wird in der Vakuumkammer die Elutionsplatte unter der Filterplatte positioniert. Alle Bewegungen der Platten und des Vakuumkammerdeckels werden vollautomatisch vom Greifer durchgeführt- Jedem Behälter der Filterplatte werden 120 µl Elutions-Puffer zugefügt- Die Proben werden fünf min bei Raumtemperatur inkubiert- 500 mbar Unterdruck werden zwei min lang ausgeübt, danach werden die Proben in die Elutionsplatte filtriert - Die Auffangplatte mit der aufgereinigten Gesamt-RNA wird zur sicheren Aufbewahrung in den Kühlturm transferiert (Abb. 4)

Ergebnisse

Die Abbildungen 5 und 6 zeigen mit der beschriebenen Methode aufgereinigte Gesamt RNA-Proben. In Abbildung 5 (1,3% Formaldehyd-Gel gefärbt mit Ethidiumbromid) wurden die Proben in Banden 1 bis 4 aus Hirn und in Banden 6 bis 9 aus Leber isoliert. Bande 5 ist der RNA-Marker. Ca. 13 mg des Ursprungsgewebes wurde für jede Probe verwendet, daraus wurden 0,3 bis 0,4 µg/mg Gesamt-RNA gewonnen. Bei allen aufgereinigten Proben lag das gemessene A260/280 Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0. Genomische DNA-Kontamination konnte nirgendwo festgestellt werden. Die Gesamtaufreinigungszeit für 96 Proben betrug ca. eine Stunde.

Schlussfolgerung

Beim Einsatz etablierter Kits, z.B. NucleoSpin 96 RNA, produziert Theonyx eine hohe Ausbeute intakter RNA im mittleren und Hochdurchsatz. Die eluierten Proben sind hochrein und können unmittelbar in nachfolgenden Schritten, wie z.B. Reverse Tranksriptase PCR/Quantitative PCR verwendet werden. Zum Vergleich wurde auf dem Roboter isolierte RNA mit nach der TRIzol Methode mit NucleoSpin 96 isolierter RNA anhand der Ergebnisse nach der Array-Hybridisierung verglichen.

Dabei schnitten die auf dem Roboter isolierten Proben besser ab als die manuell isolierten. Andere RNA Isolierungs-Kits (z.B. Qiagen RNeasy) können ebenfalls auf Theonyx automatisiert werden. Das offene Plattform-Design von Theonyx erlaubt die unkomplizierte Konfiguration mit weiteren Modulen für zusätzliche Applikationen, einschließlich einer nachfolgenden Microarray-Probenvorbereitung und/oder dem Ansatz von RT-PCR Reaktionen. Der Anwender kann das System so konfigurieren, dass es je nach Bedarf nur einige oder alle Schritte dieser Prozesse automatisiert.

Danksagung

MWG Biotech AG dankt Pekka Kallunki (Lundbeck A/S, Copenhagen) für die Bereitstellung der Gewebeproben.

*Dr. U. Lieberwirth und S.Naumann, MWG Biotech AG, Anzinger Straße 7, D-85560, Ebersberg, Germany

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