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Durchflusszytometrie

Bakterielle Biokunststoffproduktion durchflusszytometrisch verfolgt

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Durchflusszytometrie

Seit den 1970er Jahren hat die Durchflusszytometrie große Entwicklungsschritte bezüglich ihrer Lasertechnologie und Durchflusszelle erzielt. Die Geräte sind kleiner, kostengünstiger und anwendungsfreundlicher geworden. So konnten die sehr gut etablierten Anwendungen im Medizinbereich (z.B. Immunologie, Hämatologie) mit der Entwicklung neuer Fluoreszenzfarbstoffe und Lichtfilter auf die Analyse von Mikroorganismen adaptiert werden. Im Lebensmittelsektor und neuerdings auch in der Trinkwasseraufarbeitung, hat die Durchflusszytometrie unterdessen ihren festen Platz gefunden [4]. Die industrielle Anwendung der Durchflusszytometrie in der Produktion von PHB ist jedoch noch nicht etabliert. Erste Ansätze wurden in den frühen 1980er Jahren mit Nilrot als lipophiler Fluoreszenzfarbstoff durchgeführt [5]. Starke Hintergrundfärbung, schnelles Ausbleichen und die relativ lange Färbezeit erschwerten die Handhabung im Forschungslabor. Erst mit der Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffes BODIPY 493/503 konnte die Färbung verbessert und die Fluoreszenzsignale eindeutig für die Quantifizierung des PHB-Gehaltes in der Zelle benutzt werden [6]. Diese PHB-Analysemethode bietet für die Syngas-Fermentation mit R. rubrum entscheidende Vorteile: Die Messresultate sind noch während der Fermentation, sogar beinahe in Echtzeit, verfügbar und es werden nur kleine Probenvolumina (0,5 mL mit optimal 106 Zellen mL-1) benötigt. Diese Vorteile sind umso wichtiger, da eine erste Fermentation gezeigt hatte, dass eine Batchkultur mehr als eine Woche in Anspruch nehmen kann. Die gut etablierte Analyse des PHB-Gehaltes von gefriergetrockneten Bakterien mittels Gaschromatografie ist sehr arbeitsaufwändig, benötigt mindestens 50 mg Biomasse und dauert in der Regel bis zu fünf Tage bis zur vollständigen Auswertung. Da die Zellkonzentration zu Beginn von Batchkulturen sehr niedrig ist, wird ein größeres Probenvolumen benötigt. Daher wird im Synpolprojekt eine volle Automatisierung der PHB-Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie angestrebt, auch um die Probenmenge möglichst klein zu halten und den Bioprozess auch während der Randzeiten verfolgen zu können.

Automatisiert und online

Für die Online-Durchflusszytometrie gibt es bereits Geräte auf dem Markt, die für die Qualitätskontrolle von Trinkwasser vorgesehen sind. Stichproben des Wassers werden automatisch entnommen, mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt und die Zellzahl bestimmt [4]. Da diese Geräte jedoch nur Zellzahlen zwischen 102 und 106 Zellen mL-1 korrekt messen können, muss für die Verfolgung der PHB-Produktion – speziell für Bioprozesse mit hohen und stets zunehmenden Zelldichten – ebenfalls eine flexible, automatische Verdünnung bis zu einem Faktor 1000 etabliert werden. Verschiedene Ansätze basieren auf dem grafischen Programmiersystem Labview (National Instruments), das die einfache Modifikation der Verdünnungs- und Färbeschritte erlaubt. Messintervalle von 15 Minuten sind gut realisierbar [7,8]. Zurzeit wird an der HES-SO ein neues Analysesystem entwickelt, das die Messzeit weiter reduzieren soll. Im Rahmen des Synpol-Projektes wird das Online-Durchflusszytometer für die Wahl des optimalen Fermentationsprozesses (Fed-Batch oder Chemostat) und der entsprechenden Mediumsoptimierung eingesetzt werden.

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