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Extraktionstechniken zur Analyse von Aromastoffen im Vergleich Blick in den Joghurt: Flüssigextraktion in fester Form?

Ein Gastbeitrag von Guido Deußing*

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Geschmacks- und Aromastoffe zu bestimmen, setzt den Einsatz geeigneter Extraktionstechniken voraus. Welche bei der Analyse hydrophiler/polarer Verbindungen die Nase vorn hat, wurde unlängst von Applikationsexperten untersucht.

Abb. 1: Schematische Darstellung der SA-SBSE/SBSE-LD-LVI-GC-MS und der sensorischen Bewertung.
Abb. 1: Schematische Darstellung der SA-SBSE/SBSE-LD-LVI-GC-MS und der sensorischen Bewertung.
(Bild: Nobuo Ochiai et al.; © New Africa - stock.adobe.com)

Jedes Ding hat seine Eigenart, die es für bestimmte Anwendungen eher prädestiniert als für andere. Das gilt auch für Extraktionstechniken, wie sie zur Bestimmung flüchtiger organischer Verbindungen (engl. Volatile Organic Compounds, VOC) mittels Gaschromatographie (GC) Anwendung finden. Ein Team von Applikationsexperten ist unlängst der Frage nachgegangen, welche Extraktionstechnik besonders geeignet sei, hy­drophile und polare Aromakomponenten in Spuren anzureichern. Bei dem Untersuchungsgegenstand handelte es sich um Joghurt (s. „Auf einen Blick“), eine aus analytischer Sicht höchst problematische Matrix.

Da mit dem Griff in die Auslage am „Point of Sales“ nicht zuletzt die Erfüllung eines bestimmten Geschmackserlebnis verbunden ist, sind lebensmittel­analytische Maßnahmen u. a. darauf fokussiert, Aroma­profile konstant zu halten oder zu verbessern sowie Störstoffe (Off-Flavors) zu identifizieren und zu ent­fernen.

Ergänzendes zum Thema
Auf einen Blick
  • Etwa 14,2 Kilogramm Joghurt pro Kopf und Jahr werden hierzulande durchschnittlich konsumiert.
  • Joghurtaromen, die den eingesetzten Rohstoffen entstammen, werden von Milchsäurebakterien im Fermentationsprozess gebildet, der durch Temperaturen um 45 °C induziert wird.
  • Der marken- bzw. produktspezifische Joghurtgeschmack wird durch Fruchtbeimengungen und Aromazusätze erreicht.

Die Bandbreite der Extraktionstechniken, mit denen sich Aromastoffe isolieren und anreichern lassen, ist umfangreich. Zu nennen sind etwa statische und dynamische Headspace-Techniken (HS/DHS), Festphasenmikroextraktionen (engl. Solid Phase Microextraction, SPME) in der Probe selbst und im Dampfraum darüber (HS-SPME). Zur Anwendung kommt die Twister- oder Rührstäbchenextraktion (engl. Stir Bar Sorptive Extraction, SBSE) – ebenfalls in der Probe (SBSE) oder darüber (HS-HSSE) – und überdies eine Reihe weiterer Techniken.

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Aus der Matrix gegriffen

Dessen ungeachtet, „aufgrund des relativ großen Einflusses der Probenmatrix, einschließlich des hohen Gehalts an Fett und fettfreien Feststoffen in Milch, ist es nicht einfach, Spuren hydrophiler bzw. polarer Verbindungen mit gängigen Extraktionstechniken zu extrahieren“, schreiben Nobuo Ochiai und Kollegen [1]. Auf der Suche nach der Lösung dieser Herausforderung nahmen die Applikationsexperten die lösungsmittelunterstützte Stir-Bar-Sorptive-Extraction (engl. Solvent-Assisted SBSE, kurz SA-SBSE) in den Blick. Die SA-SBSE war, wie Ochiai et al. referieren, 2016 entwickelt worden, „um die Extraktionseffizienz insbesondere hydrophiler und polarer Verbindungen zu erhöhen sowie Schwierigkeiten, die u. a. mit der konventionellen SPME bestanden, zu überwinden“.

Fokus auf die SA-SBSE

Für die SA-SBSE lässt man Polydimethylsiloxan (PDMS) in einem geeigneten Lösungsmittel (LM) quellen. Das LM bindet an die weitverzweigten, aus zahllosen, vielfach vernetzten Siloxan-Einheiten (Si-O-) bestehende Polymerstruktur. PDMS wird in der SPME und SBSE für die Extraktion gering- oder unpolarer Verbindungen aus polaren Matrices verwendet. Aufbau und Struktur des PDMS bedingen seine hohe Sorptionskapazität. Das wohl bekannteste PDMS-basierte wiederverwendbare Extraktionsmedium für die SBSE ist der Gerstel-Twister: Aufgrund seiner Geometrie verfügt der PDMS-Twister über eine im Vergleich mit einer konventionellen SPME-Faser signifikant größere Menge an Sorptionsphase, was dessen um ein Vielfaches höhere Extraktionsleistung gegenüber der SPME erklärt. Damit erklärt sich auch der große Nutzen der SBSE für die Spurenanalytik.

Wird nun ein polares Lösungsmittel wie Dichlormethan (CH2Cl2) vom PDMS eingelagert, lässt sich das Sorptionsspektrum des Polymers erweitern. Will sagen, der Twister kann im Rahmen der SA-SBSE auch auf die Spurenanalytik hydrophiler/polarer Verbindungen angewendet werden. Da sich CH2Cl2 dem Grund nach immer noch wie ein Lösungsmittel verhält, erfolgt bei der SA-SBSE eine Flüssigextraktion im Feststoff, wobei sich das LM nicht mit der Probenmatrix mischt, sondern stationär bleibt – durch die Rotation während des Mischvorgangs dennoch mit der gesamten Proben in Kontakt kommt – und somit nicht abgetrennt werden muss. Die Rückgewinnung der Analyten erfolgt anschließend mit einem GC-gängigen bzw. gesundheitlich weniger bedenklichen Lösungsmittel. Das kann sich letztlich als sehr nützlich für die unkomplizierte sensorische Bewertung von Aromaprofilen erweisen.

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Von Theorie und Praxis

Um die Leistungsfähigkeit der SA-SBSE bei der Extraktion und Bestimmung hydrophiler und polarer Aromastoffe aus Joghurt bewerten und einordnen zu können, untersuchten Ochiai und Kollegen in einer Vergleichsstudie aromatisierte Frucht- sowie Naturjoghurts und stellten sie jenen Resultaten gegenüber, die sie mit der konventionellen SBSE ermittelt hatten. Der Milchfettanteil lag bei den Fruchtjoghurts unter 0,5 Prozent, der Anteil an Milchfeststoffen unter 10 Prozent. Der Milchfettanteil der Naturjoghurts betrug 3 bis 4 Prozent, der Anteil an Milchfeststoffen rangierte zwischen 8 und 15 Prozent. Die Proben wurden je nach deklariertem Aromaanteil unterschiedlich stark mit Reinstwasser verdünnt und zentrifugiert. Aus dem Überstand wurden 5 mL in 10-mL-HS-Vials überführt, mit einer 30-prozentigen NaCl-Lösung versetzt und mittels SA-SBSE und SBSE bei Raumtemperatur für die Dauer von einer Stunde mit 800 U/min extrahiert.

Für die SA-SBSE verwendet wurden Twister mit einem PDMS-Volumen von 63 µL verwendet, die Ochiai et al. zuvor 30 Minuten lang in einer Lösung mit einem 1:1-Mischungsverhältnis aus Dichlormethan und Diisopropylethter hatten quellen lassen. Die Twister wurden der Probe entnommen, mit Reinstwasser gespült und einem fusselfreien Tuch trockengetupft. Für die Lösungsmitteldesorption der im Zuge SA-SBSE und der SBSE in den Twistern angereicherten Analyten wurde Aceton verwendet; der Aceton-Extrakt wurde in 2-mL-Vials überführt und auf den Multi-Purpose-Sampler (Gerstel-MPS) zur automatisierten Analyse überführt; die Probenaufgabe erfolgte als Large-Volume-Injektion (LVI) durch den MPS in die Thermal-Desorption-Unit (Gerstel-TDU) (s  u.). Die Überführung der Analyten nach Flüssiginjektion und Ausblendung des Lösungsmittels erfolgte temperaturprogrammiert unter Einsatz des TDU.

Der Vollständigkeit halber: Ochiai und Kollegen benutzen für die Bestimmung hydrophiler/polarer Verbindungen aus Joghurt ein automatisiertes Thermodesorptions-GC/MS-System bestehend aus einem Multi-Purpose-Sampler (Gerstel-MPS-robotic), der Thermal-Desorption-Unit (Gerstel-TDU 2), dem Peltier-gekühlten und temperaturprogrammierbaren Kalt-Aufgabe-System (Gerstel-KAS), einem 7890A-Gaschromatographen (Agilent Technologies) und einem massenselektiven Detektor (MSD) der Serie 5977.

Betrachtung der ermittelten Resultate

Abb. 2: Vergleich des TIC von Fruchtjoghurtaromen, gewonnen durch SA-SBSE und SBSE, gefolgt von LD-LVI-GC/MS: (a) SA-SBSE, (b) SBSE, 1. Isobutylacetat, 2. Ethylbutyrat, 3. 2-Methylbutyrat, 4. 3-Methylbutyrat, 5. Acetoin, 6. 4-Hexen-1-ylacetat, 7. Ethyllactat, 8. Hexanol, 9. cis-3-Hexenol, 10. Essigsäure, 11. Linalool, 12. Ethyl-Levulinat, 13. Buttersäure, 14. 2-Methylbuttersäure, 15. alpha-Terpineol, 16. Benzylacetat, 17. Ethyl-4-acetoxyhexanoat, 18. Hexansäure, 19. Phenethylalkohol, 20. cis-Jasmon, 21. Linaloolhydrat, 22. Ethyl-Maltol, 23. Octansäure, 24. gamma-Decalacton, 25. Nonansäure, 26. Benzoesäure, 27. Vanillin, 28. Himbeerketon. Verbindungen, die nur in SA-SBSE nachgewiesen wurden, sind in rot geschrieben.
Abb. 2: Vergleich des TIC von Fruchtjoghurtaromen, gewonnen durch SA-SBSE und SBSE, gefolgt von LD-LVI-GC/MS: (a) SA-SBSE, (b) SBSE, 1. Isobutylacetat, 2. Ethylbutyrat, 3. 2-Methylbutyrat, 4. 3-Methylbutyrat, 5. Acetoin, 6. 4-Hexen-1-ylacetat, 7. Ethyllactat, 8. Hexanol, 9. cis-3-Hexenol, 10. Essigsäure, 11. Linalool, 12. Ethyl-Levulinat, 13. Buttersäure, 14. 2-Methylbuttersäure, 15. alpha-Terpineol, 16. Benzylacetat, 17. Ethyl-4-acetoxyhexanoat, 18. Hexansäure, 19. Phenethylalkohol, 20. cis-Jasmon, 21. Linaloolhydrat, 22. Ethyl-Maltol, 23. Octansäure, 24. gamma-Decalacton, 25. Nonansäure, 26. Benzoesäure, 27. Vanillin, 28. Himbeerketon. Verbindungen, die nur in SA-SBSE nachgewiesen wurden, sind in rot geschrieben.
(Bild: Nobuo Ochiai et al.)

Die Annahme, die SA-SBSE erweise sich als die bessere Alternative zur Bestimmung hydrophiler/polarer Verbindungen (log Kow -0,36 [Acetoin] bis 3,55 [(z)-Jasmonen]) als die klassische SBSE, habe sich aus Sicht von Ochiai et al. bestätigt. Die Fundstücke wurden durch Abgleich mit entsprechenden Datenbanken bestätigt. Ihre Studie ergab nach eigenen Angaben für die Bestimmung der nach SA-SBSE gewonnenen Lösungsmittel­extrakte höhere Signalintensitäten über das gesamte TIC hinweg, verbunden mit signifikanten Unterschieden im Peakprofil, insbesondere bei den Verbindungen mit Retentionszeiten größer 20 Minuten. Darunter waren viele gesättigte Fettsäuren und Benzoesäuren. Viele der mit der SA-SBSE ermittelten Komponenten hätten im Vergleich zur klassischen SBSE eine um das Zehnfache größere Signalintensität gezeigt, etwa von Verbindungen mit einem log Ko/w kleiner 2, einer geringeren Fähigkeit zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken und mehreren funktionellen Gruppen mit Heteroatomen – was gegen eine Affinität zur LM-unbehandelten PDMS- Phase spricht. Auch die in der Molke enthaltenen Trübstoffe und andere störende Matrixbestandteile hätten die SA-SBSE kaum beeinflusst, anders als es bei der SBSE der Fall gewesen sei. Gar nicht mit der SBSE, wohl aber mit der SA-SBSE extrahiert, wurden laut Ochiai et al. z. B. Acetoin (log Ko/w -0,36 und Ethylacetat (log Ko/w 2,37) sowie Ethyl-4-acetoxyhexanoat (log Ko/w 2,3) und Linaloolhydrat (log Ko/w 2,7), was das Expertenteam mit den in den Molekülen enthaltenen bifunktionalen Diester- und Diolstrukturen begründet.

Bestätigung durch sensorische Bewertung

Abb. 3: Relation ausgewählter Verbindungen, die sowohl mittels SBSE und SA-SBSE bestimmt wurden.
Abb. 3: Relation ausgewählter Verbindungen, die sowohl mittels SBSE und SA-SBSE bestimmt wurden.
(Bild: Nobuo Ochiai et al.)

Zusätzlich zur GC/MS-Analyse führten Ochiai et al. eine sensorische Bewertung von Naturjoghurt durch. Sie verwendeten dazu durch Lösungsmitteldesorption mit Aceton gewonnene Extrakte. Auch die Twister der klassischen SBSE wurden wie die der SA-SBSE flüssigdesorbiert. Anschließend gaben sie jeweils zehn Mikroliter der Rückextrakte auf eine Mouillette, einen Filterpapierstreifen, wie er zum Abriechen von Parfum genutzt wird. Dieser wurde in der Luft geschwenkt, das Lösungsmittel verflog und die olfaktorische Bewertung des Aromaprofils konnte erfolgen. Ergebnis: „Der SBSE-Rückextrakt ergab ein butterartiges Aroma mit einer kurzen Nachnote, die sich vom ursprünglichen Produktaroma unterschieden hat“, berichten Ochiai und Kollegen. Der SA-SBSE-Extrakt hingegen habe einen langanhaltenden Geruchseindruck von Käsekuchen, Milchbonbons sowie cremigen und buttrigen Aromen hinterlassen, der konzentrierter gewesen sei als das ursprüngliche Produktaroma. Die festgestellten Aromaeigenschaften hätten das Aroma des Rohmilchjoghurts angemessen reproduziert – Zeichen für die Extraktionskraft der SA-SBSE. Aus Sicht der Applikationsexperten sei damit belegt, dass sich die SA-SBSE mit hoher Effizienz zur Extraktion hydrophiler/polarer Verbindungen eigne mit deutlich reduziertem Lösungsmittelbedarf gegenüber herkömmlichen Techniken.

Originalpublikation:

[1] N. Ochiai, K. Sasamoto, K. MacNamara, A. Hoffmann, GERSTEL Application Note 235, 2022, https://gerstel.com/de/Standard-and-Solvent-Assisted-Stir-Bar-Sorptive-Extraction

Analytica 2022: Halle A1 Stand 319

* G. Deußing, Freier Journalist, 41464 Neuss

(ID:48301033)