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Weitfeldmikroskopie

Dekonvolution – Bildverarbeitung in der Weitfeldmikroskopie

| Autor / Redakteur: Christoph Greb* / Marc Platthaus

Abb. 1: Blind Deconvolution: Menschliche Drüsenkrebszellen wurden in einem Z-Stapel abgebildet. Nach der Blind Deconvolution nimmt die Unschärfe ab. Außerdem kann der Kontrast gesteigert werden und die Intensität erhöht sich.
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Abb. 1: Blind Deconvolution: Menschliche Drüsenkrebszellen wurden in einem Z-Stapel abgebildet. Nach der Blind Deconvolution nimmt die Unschärfe ab. Außerdem kann der Kontrast gesteigert werden und die Intensität erhöht sich. (Bild: Karl-Heiz Körtje/Leica Microsystems)

Durch Kolokalisierungsstudien können Interaktionen von Zellbestandteilen sichtbar gemacht werden. Vorraussetzung für eine realitätsgetreue Wiedergabe ist jedoch die Eliminierung von Informationen außerhalb des Fokusbereichs. Die Dekonvolution steigert bei diesem Prozess sogar die Bildsensitivität.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein modernes und sich stets weiterentwickelndes Werkzeug zur Entschlüsselung aktueller zellbiologischer Fragestellungen. Mithilfe fluoreszierender Proteine und Farbstoffe ist es möglich, Zellkomponenten auf hochspezifische Weise sichtbar zu machen. Durch Kolokalisierungsstudien können heute Interaktionen von Zellbestandteilen direkt und in Echtzeit visualisiert werden. Eine besondere Herausforderung stellt dabei die dreidimensionale Abbildung der zu untersuchenden Strukturen dar, um einen Eindruck ihrer Plastizität zu gewinnen. Voraussetzung für derartige Untersuchungen ist ein leistungsfähiges Fluoreszenzmikroskop sowie eine mathematische Hilfestellung. Zur Erzeugung einer 3D-Abbildung einer fluoreszierenden Struktur wird eine Sequenz von 2D-Bildern aufgenommen, die dann zu einem Stapel zusammengestellt werden. Dabei muss man berücksichtigen, dass jedes 2D-Bild nicht nur Informationen aus der Fokusebene enthält, sondern auch Informationen aus anderen Ebenen. Aufgrund von Streulicht entsteht ein etwas unscharfes Bild mit einigen kollateralen Fluoreszenzdaten, die die Visualisierung des eigentlichen Objekts verzerren. Mit der Technik der Dekonvolution kann man mithilfe eines mathematischen Algorithmus diese nicht-fokussierten Informationen beseitigen und dadurch schärfere Bilder von spezifischen Fokusebenen sowie realistischere 3D-Eindrücke der interessierenden Strukturen erzielen.

Das Problem

Jeder Benutzer eines Fluoreszenzmikroskops möchte möglichst detaillierte Informationen über seine zu untersuchende Struktur gewinnen. Ein Problem dabei liegt in den begrenzten Fähigkeiten eines optischen Systems, ein realistisches Bild zu erzeugen. Jede Lichtquelle, z.B. ein GFP-gekoppeltes Protein, emittiert Streulicht. In der Praxis kann dadurch je nach Probendicke ein unscharfes Signal entstehen. Zur Überwindung dieses Problems wurden in der Vergangenheit unterschiedliche Ansätze entwickelt.

Auf der einen Seite werden außerhalb der Fokalebene liegende Informationen mit der Konfokalmikroskopie anhand einer raffinierten Anordnung von Lochblenden im Anregungs- und Emissionsstrahlengang ausgeschlossen. Dies führt zu einem Bild mit hoher Z-Auflösung (= geringer Tiefenschärfe) und ohne jegliche nicht fokussierte Anteile. Wegen des kleinen Konfokalvolumens, mit dem das Bild während des Scanvorgangs punktweise erzeugt wird, muss der Anwender mit einer hohen Lichtdosis arbeiten, die durch einen Laser geliefert wird. Der Vorteil eines schärferen Bildes wird also durch einen erheblichen Nachteil aufgehoben: Die hohe Energiemenge kann zu einem Ausbleichen und einer allgemeinen Schädigung der Zelle führen (Phototoxizität). Daher ist ein Konfokalsystem nicht unbedingt die erste Wahl für Lebendzell-Aufnahmen.

Auf der anderen Seite bietet ein herkömmliches (Weitfeld-) Fluoreszenzsystem – mit der Möglichkeit der anschließenden Dekonvolution – die Vorteile einer höheren Sensitivität sowie einer geringeren Strahlenbelastung. Die niedrige Lichtdosis schont die Zellen und die Fluoreszenz bleicht nicht so schnell aus. Wie schon erwähnt, werden diese Vorteile allerdings zu Lasten einer schlechteren Auflösung gewonnen.

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