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Weitfeldmikroskopie

Dekonvolution – Bildverarbeitung in der Weitfeldmikroskopie

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Um das Problem der realistischen Darstellung etwas näher zu betrachten, ist es sinnvoll, sich eine sehr kleine Struktur anzuschauen – ein Latex-Kügelchen mit einem Durchmesser unterhalb der Auflösungsgrenze. Die Beobachtung dieses dreidimensionalen fluoreszierenden Objekts in XY-Orientierung mit einem Fluoreszenzmikroskop führt zur Projektion eines leuchtenden Punkts mit unscharfer Umgebung. Die Aufnahme eines Z-Stapels ergibt die folgende Darstellung: Die Seitenansicht des Kügelchens ähnelt zwei übereinanderliegenden Kegeln mit zueinander gerichteten Spitzen. Diese Fehldarstellungen sind auf Streulicht zurückzuführen, welches während der Aufnahme des Z-Stapels erfasst wird. Ziel der Dekonvolution ist es, diese „falschen“ Informationen mithilfe einer mathematischen Berechnung zu eliminieren.

Point Spread Function

Zum besseren Verständnis der Grundlagen dieses Verfahrens dient die Erklärung eines Begriffs, der in Zusammenhang mit der Dekonvolution häufig erwähnt wird: Die Point Spread Function (Punktspreizfunktion). Um einen dreidimensionalen Eindruck eines Präparates zu erhalten, muss man, wie bereits erwähnt, eine Sequenz zweidimensionaler Bildaufnahmen zu einem Z-Stapel zusammenfügen. Dabei entsteht ein durch das Problem des Streulichtes verfälschtes, nicht perfekt rundes Abbild des Kügelchens.

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Die Ursache für dieses Phänomen liegt in der begrenzten Fähigkeit eines optischen Systems, eine punktförmige Lichtquelle zu beschreiben: Das Signal, welches die Mikroskopoptik passiert, wird durch verschiedene Parameter verzerrt. Dies sind z.B. die Systemeinstellung, die Wellenlänge, das Objektiv und dessen numerische Apertur (NA) oder die Brechzahl der Immersionsmedien. Das Ergebnis all dieser Einflüsse – in Bezug auf die Abbildung eines punktförmigen Objekts durch ein optisches System – wird als Point Spread Function (PSF) beschrieben. Physikalisch betrachtet wird das Objekt durch die PSF gefaltet (konvoluiert). Umgekehrt ist es auch möglich, mit Kenntnis der PSF das Objekt wieder zu entfalten. Logischerweise nennt man dieses Verfahren Dekonvolution (s. Abb. 2).

Wie aber erhält man eine PSF? Generell gibt es zwei Möglichkeiten, diese Information zu gewinnen. Eine genauere Methode ist die Messung der PSF. Hierzu bestimmt man die PSF eines Objektes mit bekannten Abmessungen unterhalb der Auflösungsgrenze. Diese Methode wird allerdings aus praktischen Gründen selten ausgeführt. Leichter und schneller funktioniert die Berechnung der PSF. Dieser theoretische Wert wird anhand von Daten wie den Maxima der Erregungs- und Emissionswellenlängen, oder der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs, durch einen Computeralgorithmus geschätzt.

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