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UV-Vis- und Fluoreszenzspektroskopie

DNA-Quantifizierungen sicher und effizient durchführen

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Analysegeschwindigkeiten richtig beurteilen

Die Geschwindigkeit, mit der DNA quantifiziert werden kann, variiert je nach der verwendeten Technik drastisch. Viele Gerätehersteller geben bei der Analysezeit nur die reine Messzeit an. Dies ist aber irreführend. Um die Methodendauer richtig beurteilen zu können, muss hingegeder gesamte Analyseprozess betrachtet werden. Zu diesem Prozess gehören beispielsweise:

  • eine notwendige Instrumentenaufwärmphase oder die Software-Parametrisierung
  • Probenbeladung
  • Probenverdünnung
  • Messzeit
  • Probenentnahme
  • Gerätereinigung
  • der Daten-Export
  • Konzentrations-Berechnungen

Klassische Spektralphotometer benötigen häufig Aufwärmzeiten und erfordern den zeitraubenden Einsatz von Küvetten, Verdünnungen der Probe oder auch eine manuelle Konzentrationsberechnung. Obwohl die Aufwärmphase bei modernen Systemen nicht mehr so lange dauert, kann mit küvettenlosen Systemen wie dem Nanodrop eine deutliche Zeitersparnis erzielt werden.

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Ein wesentlicher Vorteil der UV-Vis-Spektroskopie gegenüber der Fluoreszenz-Spektroskopie ist die direkte Messung der Probe, während bei der Fluoreszenz-Spektroskopie Reagenzien hergestellt und mit den Proben vor der Messung gemischt werden müssen. Dies macht die Messung zeitaufwändiger und durch die zusätzlichen Arbeitsschritte auch fehleranfälliger.

Kurven eines Standards aufnehmen

Insbesondere durch die Varianz bei der Qualität der Fluroeszenzchemikalien sowie beim Ansetzen der Proben (Inkubationszeit, Temperatur etc.) kann es hier zu abweichenden Messergebnissen kommen. Diese Unterschiede können durch die Aufnahme eines Standards ermittelt werden. Allerdings muss hier in der Regel auch eine Verdünnungsreihe hergestellt werden, die wiederum Zeit in Anspruch nimmt und eine potenzielle Fehlerquelle darstellt.

Welche Methode zur DNA-Quantifizierung ist die richtige?

Es gibt mittlerweile einige Fragestellungen, in denen die Vorteile von UV-Vis- und Fluoreszenz-Spektroskopie benötigt werden. So erfordern zum Beispiel einige der Next-Generation-Sequenzierungs-Protokolle Messungen mit beiden Techniken, um sowohl die DNA spezifisch zu quantifizieren als auch das Vorhandensein von Hemmstoffen zu beurteilen.

Für die meisten Anwendungen ist aber durchaus die Quantifizierung unter Verwendung einer der genannten Techniken ausreichend. Für relativ reine Proben ist UV-Vis-Spektroskopie die Methode der Wahl, da sie in Bezug auf Benutzerfreundlichkeit und Geschwindigkeit deutliche Vorteile zeigt. Bei niedrigen Konzentrationen oder der Anwesenheit von RNA spielt die Fluoreszenz-Spektroskopie ihre Stärken aus und der Anwender sollte die zusätzliche Zeit in Kauf nehmen. n

* A. Page: Thermo Fisher Scientific, Wilmington/USA

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