Suchen

SPECIAL PROBENVORBEREITUNG Dreidimensionale Kryo-Elektronenmikroskopie

| Autor / Redakteur: HOLGER STARK* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Methode der dreidimensionalen Kryo-Elektronenmikroskopie bietet die Möglichkeit, räumliche und zeitliche Interaktionen der Einzelkomponenten von Makromolekülen besser verstehen zu lernen.

Firma zum Thema

Abb.1: Kryo-Elektronenmikroskop, ausgestattet mit Feldemissionskathode, 200 kV Beschleunigungsspannung und Helium gekühlter, supraleitender Objektivlinse.
Abb.1: Kryo-Elektronenmikroskop, ausgestattet mit Feldemissionskathode, 200 kV Beschleunigungsspannung und Helium gekühlter, supraleitender Objektivlinse.
( Archiv: Vogel Business Media )

Die dreidimensionale Strukturbestimmung großer makromolekularer Komplexe stellt eine große Herausforderung der Biologie dar. Die Methode der dreidimensionalen Kryo-Elektronenmikroskopie bietet die Möglichkeit, räumliche und zeitliche Interaktionen der Einzelkomponenten von Makromolekülen besser verstehen zu lernen.

Seit einigen Jahren wird immer deutlicher, dass die Zugehörigkeit einzelner Proteine zu größeren makromolekularen Komplexen eher die Regel als die Ausnahme darstellt. Betrachtet man die nahezu vollständig verfügbaren Sequenzinformationen und die stetig wachsende Anzahl an Kristallstrukturen einzelner Proteine, so bleibt es eine große Herausforderung der Biologie, die Wechselwirkungen von Proteinen im Kontext makromolekularer Komplexe verstehen zu lernen. Bei den auch als „molekulare Maschinen“ bezeichneten makromolekularen Komplexen handelt es sich um große, zum Teil aus über hundert Einzelkomponenten (Protein, RNA, DNA) aufgebaute Komplexe. Stellvertretend für die Vielzahl solcher Maschinen seien hier beispielhaft nur einige genannt, wie das Ribosom, Spleißosomen, snRNPs, Exosom, Editosom, Kernpore usw., die allesamt an essentiellen Stellen im biochemischen „Alltag“ einer Zelle positioniert sind.

Bildergalerie

Untersuchung großer Moleküle

Besondere Schwierigkeiten liegen im Bereich der Strukturanalyse dieser großen Moleküle. Es gelang zwar die eindrucksvolle röntgenkristallographische Strukturbestimmung einiger Makromoleküle, wie beispielsweise ribosomale Untereinheiten und RNA-Polymerase. Beide Beispiele zeichnen sich dadurch aus, dass eine hohe Kopienzahl an Molekülen in der Zelle vorliegt und somit leicht in großen Mengen aufgereinigt werden können. Viele makromolekulare Komplexe sind im Vergleich zu Ribosomen allerdings nur in deutlich niedriger Kopienzahl zu finden und können nicht in der Qualität und den Mengen aufgereinigt werden, wie sie für die Röntgenkristallographie benötigt werden. Aufgrund eines um zwei bis drei Größenordnungen geringeren Bedarfs an Probenmaterial stellt die Kryo-Elektronenmikroskopie zurzeit die einzige Methode dar, die in solchen Fällen zur dreidimensionalen Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe zur Verfügung steht.

Die Kryo-EM funktioniert vergleichbar der Computer-Tomographie in der Medizin. Aus vielen zweidimensionalen Projektionsbildern, aufgenommen aus verschiedenen Richtungen, wird über Computer- gestützte Verfahren der Bildverarbeitung die dreidimensionale Struktur des untersuchten Objektes rekonstruiert. Mit dieser, als Einzelpartikelmethode bezeichneten Technik, können Makromoleküle in einem Größenbereich von ca. 200 kDa bis mehreren MDa strukturell untersucht und dreidimensional visualisiert werden. Die zurzeit erreichbare Auflösung dieser Technik liegt in einem Bereich von 6-25 Å, abhängig hauptsächlich von der Art der Probe (z.B. Symmetrie, Stabilität) und der Probenqualität.

Vorbereitung durch Eiseinbettung

Typischerweise werden die makromolekularen Komplexe mit unterschiedlichsten chromatographischen Methoden aus Zellen aufgereinigt. Selten werden dabei allerdings hohe Partikelkonzentrationen erreicht. Durchschnittlich erreichbare Konzentrationen von 20-50 µg/ml genügen jedoch bereits für elektronenmikroskopische Untersuchungen.

Die optimale elektronenmikroskopische Präparationsmethode für Makromoleküle ist die so genannte Eiseinbettung. Die Moleküle werden dabei durch extrem schnelles Abkühlen in flüssigem Ethan in einer dünnen, vitrifizierten Eisschicht eingebettet. Vitrifiziertes Eis ist eine amorphe, glasartige Form von Wasser mit fast identischer Dichte zu flüssigem Wasser. Diese Kryo-Präparation erlaubt es, Makromoleküle in einem nativen Zustand ohne aufwändige Kristallisation einzubetten und zu visualisieren. Die Moleküle werden bei dieser Methode in einer etwa 100 nm dicken Eisschicht fixiert und abgekühlt auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff oder Helium- im Elektronenmikroskop abgebildet (Abb. 1 und Abb. 2). Schwermetallkontrastierung ist für die Abbildung der Makromoleküle nicht erforderlich.

Für einige Proben wird jedoch auch eine Kombination aus Eiseinbettung und Schwermetallkontrastierung eingesetzt (Kryo-Negativ-Kontrastierung). Prinzipiell werden die Moleküle bei der Vitrifizierung der Proben im Bereich von Millisekunden in der Eisschicht fixiert. Daraus ergibt sich ein unschätzbarer Vorteil der Kryo-Elektronenmikroskopie, der die strukturelle Untersuchung mehrerer funktioneller Stadien der makromolekularen Maschinen ermöglicht. Zusätzlich zur statischen 3D-Struktur eines Moleküls erhält man auf diese Art und Weise auch wertvolle Informationen zur strukturellen Dynamik des untersuchten Komplexes und somit ein besseres Verständnis über die funktionsrelevanten Vorgänge der molekularen Maschinen (Abb. 4).

Moderne Elektronenmikroskope sind Hightech-Geräte, die bereits heute höchsten Anforderungen an Stabilität und Auflösung gerecht werden, deren technische Weiterentwicklung jedoch längst nicht abgeschlossen ist. Im materialwissenschaftlichen Bereich, in dem Strahlenschädigungen des Objekts eine untergeordnete Rolle spielen, werden bereits Auflösungen unter einem Angström im Bild erreicht.

Die hohe Strahlensensitivität organischer Materie hingegen stellt eine fundamentale Limitierung für die Elektronenmikroskopie biologischer Objekte dar. Daraus resultiert die Notwendigkeit, die Makromoleküle zu kühlen und mit sehr geringer Elektronendosis abzubilden (Abb. 2). Als Konsequenz liefert die Kryo-Elektronenmikroskopie allerdings stark verrauschte Bilder, die für einen ungeübten Betrachter eher unbrauchbar erscheinen. Nur über die anschließende Bildverarbeitung tausender Einzelbilder (momentan etwa 10 000-100 000) können im „Kampf gegen das Rauschen“ hochaufgelöste Strukturen berechnet werden.

Die eingesetzten digitalen Bildverarbeitungsmethoden erfordern einen hohen Rechenaufwand. Sie dienen dazu, Rohbilder richtig auszurichten, Muster in den Bildern zu erkennen, relative Projektionswinkel der abgebildeten Moleküle zu berechnen und letzten Endes die dreidimensionale Struktur bei möglichst hoher Auflösung zu rekonstruieren. Technische Entwicklungen in der Elektronenmikroskopie und die enorme Steigerung an Computer-Rechenleistung haben in den letzten zehn Jahren erheblich dazu beigetragen, die Leistungsfähigkeit der Methode kontinuierlich zu verbessern.

Interpretation der Daten

Die Interpretation der 3D-Strukturen auf atomarem Niveau ist auflösungsbedingt nicht möglich, da Seitenketten von Aminosäuren bei den momentan erreichbaren Auflösungen nicht sichtbar gemacht werden können. Die berechnete 3D-Struktur eines Komplexes ist daher ein großes dreidimensionales Puzzle, bei dem die Einzelteile aus Protein oder RNA an die richtige Stelle gebracht werden müssen. Röntgenstrukturen einzelner Komponenten sind hier sehr hilfreich, da bei Auflösungen von ungefähr zehn Å bereits Domänenstrukturen von Proteinen interpretiert werden können und so die direkte Lokalisation einzelner Proteine mit bekannter Struktur möglich wird (Abb. 4).

Um den kompletten Aufbau eines makromolekularen Komplexes verstehen zu können, sind jedoch zusätzliche Informationen notwendig. Antikörpermarkierungen stellen beispielsweise das gängigste Werkzeug zur Lokalisierung einzelner Proteinkomponenten im makromolekularen Komplex dar (Abb. 3). Biochemische Daten aus Quervernetzungsreaktionen sind ebenfalls von sehr großer Bedeutung für die Interpretation der berechneten Strukturen. Durch das Berechnen von Differenz-Dichten markierter und unmarkierter Komplexe können zudem Ligandenbindungsstellen eindeutig lokalisiert werden. Dies wurde am Beispiel des Ribosoms anhand der Lokalisation von tRNAs und Elongationsfaktoren bereits eindrucksvoll demonstriert.

Möglichkeiten und Limitierungen

Obwohl es theoretisch möglich ist, Auflösungen von etwa drei Å zu erreichen, die eine atomare Interpretation der Daten ermöglichen würden, werden in der Praxis mit der Kryo-EM zurzeit hauptsächlich Strukturen im Auflösungsbereich von 10-30 Å berechnet. Die Gründe hierfür dürften in der Vielzahl praktischer Probleme liegen, die sich dem Anwender stellen. Eines der Hauptprobleme sind strukturelle Inhomogenitäten der untersuchten Probe. Die Methode basiert prinzipiell auf der Annahme, dass alle elektronenmikroskopischen Bilder des Makromoleküls von exakt demselben dreidimensionalen Objekt abstammen. Bei großen makromolekularen Maschinen ist es allerdings nicht überraschend, wenn sich die aufgereinigte Probe aus einer Mischung von Komplexen zusammensetzt, die sich jeweils in unterschiedlichen funktionellen Zuständen befinden können.

Diese können sich in ihrer 3D-Struktur erheblich unterscheiden, und einzelne Elemente können durchaus Bereiche von sehr großer Flexibilität aufweisen. Diese beweglichen Bereiche im Makromolekül werden durch das Ausmitteln beim Berechnen der 3D-Struktur praktisch unsichtbar und stellen Fehlerquellen für die computergestützte Bildverarbeitung dar. Diese Fehlerquellen sind momentan die entscheidenden auflösungslimitierenden Faktoren. Da die biochemische Aufreinigung empfindlicher Makromoleküle jedoch nicht beliebig verbessert und um weitere Aufreinigungsschritte erweitert werden kann, müssen solche Mischpopulationen im Computer, sozusagen in silico aufgereinigt werden. An diesen und weiteren praktischen Problemen muss zurzeit noch gearbeitet werden, bevor erste „atomar“ aufgelöste Strukturen mit der Kryo-Elektronenmikroskopie bestimmt werden können.

Literatur[1] Boehringer, D., E.M. Makarov, B. Sander, O.V. Makarova, B. Kastner, R. Luhrmann, and H. Stark, Three-dimensional structure of a pre-catalytic human spliceosomal complex B. Nat Struct Mol Biol, 2004. 11(5): p.463-8[2] Golas, M.M., B. Sander, C.L. Will, R. Luhrmann, and H. Stark, Molecular architecture of the multiprotein splicing factor SF3b. Science, 2003. 300(5621): p. 980-4[3] Stark, H., Three-dimensional Electron Cryomicroscopy of Ribosomes. Current Protein and Peptide Science, 2002. 3[4] Stark, H., P. Dube, R. Luhrmann, and B. Kastner, Arrangement of RNA and proteins in the spliceosomal U1 small nuclear ribonucleoprotein particle. Nature, 2001. 409(6819): p. 539-42[5] van Heel, M., B. Gowen, R. Matadeen, E.V. Orlova, R. Finn, T. Pape, D. Cohen, H. Stark, R. Schmidt, M. Schatz, and A. Patwardhan, Single-particle electron cryo-micrsocopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys, 2000. 33(4): p. 307-369[6] Henderson, R., The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Q Rev Biophys, 1995. 28(2): p. 171-93

* Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Am Fassberg 11, 37077 Göttingen

(ID:148554)